檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第1頁2第一節(jié)化學發(fā)光免疫分析技術第二節(jié)電化學發(fā)光免疫分析第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法第四節(jié)熒光偏振免疫分析法第五節(jié)化學發(fā)光免疫分析臨床應用內(nèi)容概述:檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第2頁3教學目標和要求

掌握化學發(fā)光免疫分析技術基礎原理、反應底物和標識方法以及反應類型。

熟悉電化學發(fā)光免疫分析基礎原理和標識物，時間分辨熒光免疫分析法基礎原理及其標識物和螯合物。

了解熒光偏振免疫分析法基礎原理和技術特點，化學發(fā)光免疫分析臨床應用

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第3頁4第一節(jié)化學發(fā)光免疫分析技術基礎原理反應底物標識方法反應類型相關儀器檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第4頁5一、基礎原理化學發(fā)光，是指伴隨化學反應過程所產(chǎn)生發(fā)光發(fā)射現(xiàn)象。一些物質在進行化學反應時，吸收了反應過程中所產(chǎn)生化學能，使反應物分子形成電子激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)返回到穩(wěn)定基態(tài)時，多出能量就以光子形式發(fā)射出來。這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。A+BC*+D,C*C+h

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第5頁6(一)產(chǎn)生化學發(fā)光反應條件和過程化學發(fā)光與熒光區(qū)分:化學能光能化學發(fā)光反應條件:反應必須提供足夠激發(fā)能焓變(△H)介于170～300kj·mol-1之間，才能在可見光范圍觀察到化學發(fā)光現(xiàn)象吸收了化學能后處于激發(fā)態(tài)分子或原子，必須以光子形式將能量釋放出來，或者將能量轉移到另一個物質分子上并使該分子激發(fā)，當被激發(fā)分子回到基態(tài)時，也以光子形式釋放能量檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第6頁7(二)化學發(fā)光效率化學發(fā)光反應發(fā)光效率(φCl)又稱為化學發(fā)光總能量產(chǎn)生率φCl取決于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學激發(fā)效率(φCE)和激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子發(fā)射效率(φEM)。普通化學發(fā)光反應，φCl值約為10-6

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第7頁8(三)強度與反應物質濃度之間關系反應物濃度反應速度化學發(fā)光反應所發(fā)出光強度檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第8頁9(四)化學發(fā)光反應類型直接化學發(fā)光間接化學發(fā)光1．直接化學發(fā)光化學反應釋放化學能激發(fā)是反應產(chǎn)物分子A+BC*+D,C*C+h

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第9頁102．間接化學發(fā)光(敏化化學發(fā)光)在化學反應中，激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應分子上，使該分子到達電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)時發(fā)光；或反應首先生成一個高能量中間體，此中間體再將能量轉移給另一個未參加化學反應分子，使該分子到達電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子躍遷回到基態(tài)時發(fā)光過程。A+BC*+D,C*+FF*+E,F*F+h

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第10頁11二、反應底物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)在化學發(fā)光反應中，參加能量轉移并最終以發(fā)射光子形式釋放能量化合物發(fā)光免疫技術中常見化學發(fā)光底物:１．氨基苯二酰肼類主要有魯米諾(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和異魯米諾(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．瞇唑類化合物較常見是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉堿(lophine)。3．吖啶酯類經(jīng)典代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光澤精(1ucigenin)。4．苯酚類化合物其中主要有鄰苯三酚，即焦性沒食子酸。5．芳香草酸酯類主要有雙-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和雙-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6．(金剛烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第11頁12檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第12頁13三、標識方法化學標識生物標識化學標識:用于化學發(fā)光(酶)免疫測定直接用發(fā)光物質(如魯米諾、吖啶酯類等)標識抗體或抗原以催化劑(如HRP、GOD等)和／或協(xié)同因子(如ATP、NAD等)標識抗體或抗原按照標識物應用:檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第13頁14按照被標識物結構或性質:對小分子物質(如甾體激素、藥品等)標識對大分子抗原、抗體標識(如蛋白質、核酸等)以及對一些配基和載體標識檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第14頁15按照標識反應過程和形成結合物結構特點:直接偶聯(lián)間接偶聯(lián)經(jīng)過偶聯(lián)反應，使標識物分子中反應基團直接連接在被標識分子反應基團上。在標識物與被標識物之間插入一條鏈或一個基團，使兩種物質經(jīng)過這種引入“橋”連結成結合物碳二亞胺縮正當、過碘酸鹽氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法和混合酸酐法琥珀酰亞胺活化法、O-(羧甲基)羥胺法、異硫氰酸酯衍生物和戊二醛法檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第15頁16檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第16頁17常見標識方法1．碳二亞胺（EDC）縮正當此法可用于蛋白質分子中游離羧基或游離氨基標識。常見縮合劑有l(wèi)-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)直接偶聯(lián)檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第17頁18

2．重氮鹽偶聯(lián)法(又稱重氮化法)此法簡易、成本低、重復性好，但不適合用于脂肪伯胺基發(fā)光劑，因其生成重氮鹽不穩(wěn)定，即使在０℃也會生成氮氣。另外，ABEI等伯胺基位于側鏈者也不適用此法。芳香伯胺直接偶聯(lián)檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第18頁193．過碘酸鹽氧化法標識物可用發(fā)光劑或催化劑，適合用于芳香伯胺或脂肪伯胺發(fā)光劑，標識方法穩(wěn)定標識物不易脫落，但此法不適合用于無糖基蛋白質和含有糖基但氧化后會影響免疫學活性蛋白質。直接偶聯(lián)檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第19頁204．戊二醛法

間接偶聯(lián)芳香伯胺基氨基因為戊二醛在溶液中以單體和聚合體形式存在，后者占多數(shù)，所以在標識反應中雙方分子間組成較大距離，降低了在抗原抗體反應時空間位阻；但因偶聯(lián)不易定量控制且缺乏特異性等而未得到廣泛應用雙功效偶聯(lián)劑檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第20頁215．琥珀酸酐法(環(huán)內(nèi)酸酐法)間接偶聯(lián)此法沒有雙功效交聯(lián)劑不良反應，能實現(xiàn)標識物和蛋白質分子間單向定量縮合，標識效率高，已經(jīng)有商品化試劑供給。檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第21頁226．異硫氰酸酯衍生物法此法標識溫和、穩(wěn)定，取得標識物不易脫落，且不損失蛋白質等生物活性發(fā)光標識物標識物間接偶聯(lián)檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第22頁237．O-(羧甲基)羥胺法O--羧甲基衍生物8．混合酸酐法檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第23頁24四、反應類型化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析微粒子化學發(fā)光免疫分析依據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應不一樣體系和標識方法不一樣檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第24頁251.化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)用化學發(fā)光劑直接標識抗原或抗體,免疫反應后生成標識免疫復合物,經(jīng)過開啟發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)作用于AE而發(fā)光，發(fā)光強度依賴于免疫反應物中化學發(fā)光劑濃度。原理:常見化學發(fā)光劑:吖啶酯(acridiniumester，AE)類化合物反應特點:CLIA檢測小分子抗原采取競爭法；大分子抗標準采取夾心法。與大分子結合不會減小所產(chǎn)生光量，從而增加靈敏度。強烈直接發(fā)光在1s內(nèi)完成，為快速閃爍發(fā)光。應用:檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第25頁261)直接化學發(fā)光使用吖啶酯(AE)作為標識物，無需附加催化劑。AE氧化直接發(fā)光，氧化反應在430nm處快速發(fā)光并在1s內(nèi)到達峰值。發(fā)光強度是I125在1min內(nèi)發(fā)光強度十萬倍，所以系統(tǒng)該含有高速度、產(chǎn)光強等特點。

2)AE有甲基，增加了試劑穩(wěn)定性，使試劑穩(wěn)定性好，使用期更長。

3)AE作為化學發(fā)光標識物，對溫度及pH等外界環(huán)境改變不敏感，故其含有很高精密度。

4)AE相對分子質量水常小(MW：481)，使其對結合反應空間位阻作用降低，增加擴散率，提升了靈敏度，可達l0-15mol·L-1。

5)AE是以共價鍵結合抗體而不影響抗體結合抗原反應，故不影響發(fā)光。

6)AE加堿后，發(fā)光是在一暗盒中進行，其光量值與濃度有著良好線性關系，且本底較低。吖啶酯特點檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第26頁272．化學發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmnunoassay，CLEIA)采取參加發(fā)光效應酶作為標識物標識抗體或抗原，免疫反應后形成酶標識抗原抗體復合物，利用魯米諾作為發(fā)光底物在酶和開啟發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)催化下，產(chǎn)生發(fā)光反應，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶濃度。原理:

底物產(chǎn)物發(fā)光Ag+Ab*Ag-Ab**檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第27頁28常見標識物:辣根過氧化物酶(HRP)或ALP反應特點:①標識物常標識抗體；②標識物作為發(fā)光反應催化劑，本身不發(fā)光。檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第28頁293．微粒子化學發(fā)光免疫分析(microparticlechemiluminescenceimmunoassay，MLIA)以順磁性微粒作為載體包被抗體，利用磁性微粒能被磁場吸引，在磁力作用下發(fā)生力學移動特征，快速捕捉到被測抗原。加入堿性磷酸酶標識第二抗體，形成磁性微粒包被抗體-抗原-酶標識抗體復合物經(jīng)洗滌去掉未結合抗體后，加入ALP發(fā)光底物AMPDD，AMPDD被復合物上ALP催化發(fā)光,發(fā)射光所釋放光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)統(tǒng)計，經(jīng)過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標準曲線上轉換為待測抗原濃度。原理:檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第29頁30

AMPDD一側芳香基團上磷酸酯被水解，失去一個磷酸基而生成一個中等穩(wěn)定中間體AMPPD(半衰期2～30min)，此中間體經(jīng)過內(nèi)部電子轉移而裂解為一分子金剛烷酮和一分子激發(fā)態(tài)間氧苯甲酸甲酯陰離子，當回到基態(tài)時發(fā)出波長為470nm光)檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第30頁31常見標識物:ALP反應特點:①可采取競爭法和夾心法,多采取雙抗體夾心法②采取磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為標識物，固相載體應用擴充了測定范圍,檢測水平可茯Pg·mL-1，重復性好。

檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第31頁32五、相關儀器介紹ADVIACENTAUR全自動免疫分析儀檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第32頁33(一)ADVIACENTAUR檢測原理利用化學發(fā)光和磁性微粒子分離技術相結合測定方法，用高敏感性吖啶酯作為化學發(fā)光標識物，以極細磁性顆粒(PMP)作為固相載體，提供最大包被面積。1．液相吖啶酯(AE)。2．固相氧化鐵(Fe2O3)。包被面積大,降低了擴散時間,增加了捕捉效率檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第33頁34

(二)ADVIACENTAUR反應類型

1．雙抗體夾心法檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第34頁352．競爭法包含AE標識抗原法和AE標識抗體法。檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第35頁363．捕捉法

常見來檢測樣本中特異性抗體，又稱為抗體捕捉法。試劑中使用了一個抗人免疫球蛋白抗體?？贵w捕捉法通常使用兩次溫育和洗滌，第一次溫育和洗滌是為了除去樣品中過多干擾物質；第二次溫育和洗滌是為了檢測樣品中抗體。檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第36頁37第二節(jié)電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)是對電極施加一定電壓進行電化學反應，反應產(chǎn)物之間或體系中某種組分發(fā)生化學發(fā)光，用普通化學伎倆測量發(fā)光光譜及強度從而對物質進行痕量分析一個方法。電化學發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是將ECL和免疫反應(抗原抗體反應)融為一體標識免疫分析技術,是一個在電極表面由電化學引發(fā)特異性化學發(fā)光反應.檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第37頁38一、基礎原理檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第38頁39技術特點1．ECLIA為非核素方法，可防止核素放射性污染2．為均相免疫測定技術，檢測中不需要分離結合相和游離相，操作簡便3．磁性微珠包被技術應用使檢測靈敏度更高、線性范圍更寬、反應時間更短。4．標識物Ru

穩(wěn)定性好，室溫下半衰期大于1年，所標識蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．標識物可進行化學修飾，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子結合活性NHS酯或磷酰胺基團，可用于各種分析物檢測。6．標識物相對分子質量小，在一個抗體分子上可同時標識許多標識物分子而不影響抗體免疫學活性，也可用于核酸標識而不影響探針雜交活性。7．標識物再循環(huán)利用使發(fā)光反應時間更長、發(fā)光強度更高，更易于測定。8．儀器沒計使操作較為簡便，更易于實現(xiàn)自動化。檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第39頁40二、標識物釕衍生物，分子結構簡單、穩(wěn)定、相對分子質量小、水溶性強、空間位阻小等特點，可與待測物質進行全量反應．使得ECLIA測定含有高效性與穩(wěn)定性且沒有噪聲干擾。三聯(lián)吡啶釕檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第40頁41第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法一、基礎原理抗原抗體反應熒光物質標識

時間分辨技術++原理：檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第41頁42用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物(代替熒光物質、放射核素或酶)，經(jīng)過雙功效基團螯合劑與蛋白質、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞以共軛雙鍵結合進行標識，待反應體系(如抗原抗體免疫反應、生物素親和素反應、核酸探針雜交反應、靶細胞與效應細胞殺傷反應等)發(fā)生后，三價稀土離子螫合物能夠在紫外光激發(fā)下，發(fā)出強度高(波長為613nm左右)、連續(xù)時間長(10～l000μs)熒光，利用延緩測量時間，待樣品中蛋白質等背景熒光完全淬滅后，再測量三價稀土離子螯合物特異熒光，依據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應體系中分析物濃度，到達定量分析目標檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第42頁43時間分辨技術消除背景熒光:

在檢測樣品中，含有各種蛋白質和其它化合物，這些物質在較大波長范圍內(nèi)都可產(chǎn)生自發(fā)熒光,壽命短.

鑭系離子熒光壽命很長（10us～1.0ms），比背景熒光長3～4個數(shù)量級。所以應用熒光時間分辨技術在背景熒光已經(jīng)降到很低時再開始檢測稀土鰲合物熒光，從而消除了非特異性熒光干擾。解離-增強原理:

較大Stocks位移（即激發(fā)光波長與發(fā)射光波長之差）和較窄發(fā)射峰等都增大了檢測信噪比;特點：檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術和儀器第43頁44二、標識物和螯合劑1．TRF