小鼠糞便細(xì)菌基因組dna提取方法的比較

腸道是動物體內(nèi)最大的消化器官，其中包含大量的細(xì)菌細(xì)菌，形成極其復(fù)雜的細(xì)菌微生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生態(tài)系統(tǒng)中動物群體的結(jié)構(gòu)、數(shù)量和類型的變化與身體的健康和疾病密切相關(guān)。糞便的主要成分是微生物的菌體和食物殘?jiān)?其中包含著重要的腸道微生物信息,可以間接地反映腸道微生物的變化情況。近年來隨著分子生物學(xué)研究和技術(shù)的發(fā)展,利用分子生物學(xué)技術(shù)和方法從糞便中提取腸道微生物總DNA,并對相關(guān)疾病進(jìn)行研究取得了許多突破本研究是在已有報(bào)道的基礎(chǔ)上比較幾種小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA提取方法,旨在保證提取效率的同時得到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA,為腸道微生態(tài)系的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1細(xì)菌基因組dna提取樣品的采集與儲存:BALB/C清潔級小鼠由首都醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,3周齡,體重18~22g,直接從小鼠肛門處收集糞便于1.5mL的無菌管中,放入-80℃保存,備用。試劑:三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE,國產(chǎn));十二烷基磺酸鈉(SDS,國產(chǎn));核糖核酸酶A(RNaseA,Promega公司);蛋白酶K(Promega公司);氯化鈉(NaCL,國產(chǎn));十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,國產(chǎn));氯仿(國產(chǎn)分析純);異丙醇(國產(chǎn)分析純);Tris酚(國產(chǎn));異戊醇(國產(chǎn)分析純);無水乙醇(國產(chǎn)分析純);λDNA/HindⅢDNAMarker(TIAN-GEN公司);100bpDNAladderMarker(TIANGEN公司);Gel-Red核酸染料(Sigma公司);瓊脂糖(Sigma公司);熒光定量PCR試劑盒(ABI公司);引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成);糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型TIANampStoolDNAKit,TIANGEN公司)。儀器:Q5Real-timePCR擴(kuò)增儀(ABI公司);電泳儀(Bio-Rad公司);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);NanoDrop2000紫外分光光度儀(Thermo公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(VILBERLOURMA公司);漩渦混合器(國產(chǎn));電熱恒溫水浴鍋(國產(chǎn))。2實(shí)驗(yàn)方法2.1蒸清、煮清、水煮方法1———研磨:稱取0.1g小鼠糞便放入滅菌研缽中,在冰上徹底研碎,然后加入1mL無菌雙蒸水徹底重懸,10000r/min、離心10min,取上清待用。方法2———水煮:在0.1g小鼠糞便中加入1mL無菌雙蒸水于1.5mL的EP管中,浸泡10min后充分振蕩搖勻15s;將管放置100℃水浴10min;冷卻后10000r/min、離心10min,取上清待用。2.2te緩沖液tab/ncl(1)改良CTAB方法:參照文獻(xiàn)[6](有改動),分別在預(yù)處理過的500μL樣品中加入30μL、10%SDS,3μL蛋白酶K(20g/L),4μLRNaseA后混勻,37℃水浴1h;每管中加入100μLNaCL(5mol/L),顛倒混勻后加入80μL的CTAB/NaCL(10%CTAB,0.7mol/LNaCL),輕輕混勻;放入65℃水浴10min;加入等體積酚/氯仿/異戊醇(比例為25∶24∶1)混合液,混勻后12000r/min、離心10min,取上清;上清液中加入0.6倍體積的異丙醇,輕輕混勻,12000r/min、離心10min,棄上清;沉淀用1mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌后,7500r/min離心5min,棄乙醇,在潔凈工作臺中稍加干燥,溶于30μLTE緩沖液中。(2)試劑盒方法:將預(yù)處理好的樣品,分別按照糞便細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)說明書的步驟進(jìn)行提取。2.3大鼠糞便細(xì)菌群的dna質(zhì)量分析2.3.1細(xì)菌組的dna純度和濃度的測量分別取2μL提取到的細(xì)菌基因組DNA,在NanoDrop2000紫外分光光度儀上檢測DNA的質(zhì)量濃度及DNA的A2.3.2瓊脂糖凝膠電泳分別取5μL提取到的DNA于含Gel-Red核酸染料的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,工作電壓120V,50min后置于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析結(jié)果。2.3.3熒光定量pcr反應(yīng)使用細(xì)菌16SrDNA基因V3區(qū)特異性引物338-F:5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’,548-R:5’-AATACGGAGGGTGCAAGCGT-3’,以提取到的小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA為模板,進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴(kuò)增,每個樣本設(shè)置3次重復(fù),同時設(shè)置不添加模板的陰性對照組。根據(jù)PowerSYBRGreenmastermix說明書配置熒光定量PCR反應(yīng)體系20μL。反應(yīng)條件:95℃、10min,95℃、15s,58℃、30s、72℃,30s,40個循環(huán);反應(yīng)完成后利用熔解曲線分析產(chǎn)物的特異性,觀察其擴(kuò)增曲線以及記錄Ct值(反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù));擴(kuò)增產(chǎn)物在含Gel-Red核酸染料的1%瓊脂糖凝膠中電泳(電壓100V,50min),結(jié)果于凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察、分析。2.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件,對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。3結(jié)果3.1不同水煮法和研磨法提取dna的比較結(jié)果見表1。由表1可知:采用相同預(yù)處理方法的樣本,改良CTAB法提取到的DNA質(zhì)量濃度c(DNA)明顯高于試劑盒法提取到的;對于采用相同的提取方法、不同預(yù)處理方法的樣本提取到的DNA質(zhì)量濃度不同,與水煮法相比,研磨法能顯著提高小鼠糞便細(xì)菌基因組的c(DNA);不同方法提取到的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量濃度之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。A3.2小鼠糞便細(xì)菌基因組dna條帶的提取通過瓊脂糖凝膠電泳圖(見圖1)可見:不同方法提取到的DNA均在23kb左右處有清晰條帶;相同預(yù)處理方法的樣品,改良CTAB法提取到的小鼠糞便細(xì)菌基因組DNA條帶較亮;采用相同DNA提取方法,水煮法預(yù)處理過的樣本提取到的細(xì)菌基因組DNA有明顯的拖帶,說明提取到的DNA發(fā)生了降解,DNA分子的完整性變差。3.3熒光定量pcr檢測細(xì)菌16srdna基因序列利用不同方法提取到的糞便細(xì)菌基因組DNA為模板,采用相同DNA模板量對細(xì)菌16SrDNA基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的溶解曲線上顯示每個樣品擴(kuò)增的16SrDNA基因均為單一峰,特異性較好(見圖2)。圖3的PCR擴(kuò)增曲線顯示:以研磨結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA為模板擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA基因得到的Ct值最低,與水煮結(jié)合改良CTAB法提取到的DNA擴(kuò)增得到的Ct值相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),具體結(jié)果見表2。對熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明:擴(kuò)增產(chǎn)物均可以在200bp左右看到細(xì)菌16SrDNA基因的特異性擴(kuò)增片段,且無干擾性雜帶,重復(fù)性好(見圖4);研磨結(jié)合CTAB法獲得的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物條帶最亮;經(jīng)過水煮法預(yù)處理的樣品,不同提取方法提取到的DNA擴(kuò)增后的產(chǎn)物條帶均較暗,說明經(jīng)過水煮預(yù)處理的樣品提取到的細(xì)菌基因組DNA濃度較低,質(zhì)量較差。4不同方法提取的細(xì)菌基因組dna從糞便中有效地提取到高質(zhì)量的細(xì)菌基因組DNA是研究腸道微生態(tài)的基礎(chǔ)和前提。目前,從糞便標(biāo)本中提取細(xì)菌DNA的方法眾多,由于提取機(jī)理和步驟的差別,獲得DNA的濃度和純度各不相同,導(dǎo)致在后續(xù)實(shí)驗(yàn),如PCR擴(kuò)增、DNA測序等的應(yīng)用效果不同本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:經(jīng)過不同預(yù)處理的樣本,采用相同的細(xì)菌基因組DNA提取方法提取到的DNA質(zhì)量濃度不同,研磨預(yù)處理后提取到的細(xì)菌基因組DNA質(zhì)量濃度明顯高于經(jīng)水煮后提取到的DNA質(zhì)量濃度。有文獻(xiàn)報(bào)道機(jī)械破壁對厚壁菌門的破壁效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的酶解作用水煮法是利用物理方法處理蛋白質(zhì),使其與核酸分離,但是在加熱過程中菌體破裂的比例較小,而且煮沸過程中部分DNA發(fā)生降解此外細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,經(jīng)過水煮法預(yù)處理過的樣品,提取到的DNA完整性較研磨預(yù)處理后提取到的DNA差。已有的研究法發(fā)現(xiàn)把經(jīng)過相同預(yù)處理的樣本,采用不同提取方法提取到的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行綜合比較發(fā)現(xiàn):改良CTAB方法提取到的DNA質(zhì)量濃度明顯高于試劑盒法提取到的DNA質(zhì)量濃度;改良CTAB方法的DNA純度低于試劑盒法提取到的DNA純度。試劑盒的方法操作簡單、用時短,提取到的DNA質(zhì)量穩(wěn)定,但是熒光定量PCR的擴(kuò)增效果比改良CTAB法的差,而且試劑盒價格較貴,使用次數(shù)有限,試劑盒的質(zhì)量因不同廠家和批次也會有所差異,不適合大量樣本的糞便細(xì)菌基因組DNA的提取。改良的CTAB方法提取到的細(xì)菌基因組DNA條帶完整、較亮,沒有明顯的降解和蛋白質(zhì)污染;以此為模板進(jìn)行細(xì)菌16SrDNA基因熒光定量PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰,說明改良的