實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的定量測(cè)定

——Folin-酚試劑法(Lowry法)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的定量測(cè)定

——Folin-酚試劑法(Low蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)（一）雙縮脲反應(yīng)是由兩分子尿素縮合成一種化合物的反應(yīng)。2尿素雙縮脲+氨180度

雙縮脲在堿性溶液中與銅離子結(jié)合生成復(fù)雜的紫紅色絡(luò)合物，這一呈色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)（一）雙縮脲反應(yīng)2尿素雙縮脲+氨18蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紫紅色或藍(lán)紫色絡(luò)合物。通常可用此法來定性鑒定蛋白質(zhì)的存在，也可根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，在540nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，定量測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。允許測(cè)定范圍為0.2-1.7mg蛋白質(zhì)/ml。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲（二）蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)芳香族氨基酸特別是酪氨酸和色氨酸的蛋白質(zhì)所特有的呈色反應(yīng)。蛋白質(zhì)遇硝酸后，產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成黃色，再加堿，顏色加深呈橙黃色。（二）蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng)（三）酚試劑反應(yīng)蛋白質(zhì)分子一般都有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物（即鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。（三）酚試劑反應(yīng)（四）乙醛酸反應(yīng)在蛋白質(zhì)溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會(huì)出現(xiàn)紫色環(huán)，凡含有吲哚基結(jié)構(gòu)的化合物都有這一反應(yīng)。（四）乙醛酸反應(yīng)（五）坂口反應(yīng)精氨酸分子中所含量胍基能與次溴酸鈉（或次氯酸鈉）及α-萘酚在堿性溶液中形成紅色產(chǎn)物。（五）坂口反應(yīng)（六）米倫反應(yīng)（Ｍillon）米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸、亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)溶液中加入米倫試劑后即產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變?yōu)榧t色。酚類化合物有此反應(yīng)。（六）米倫反應(yīng)（Ｍillon）常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)定的方法凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚法紫外（UV）分光光度法考馬斯亮蘭染色法常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)定的方法凱氏定氮法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。

2.掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法和操作。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量二、實(shí)驗(yàn)原理

Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍(lán)色反應(yīng)，其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測(cè)定酪氨酸和色氨酸的含量。二、實(shí)驗(yàn)原理Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)含量高時(shí)（25-100μg）在500nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，含量低時(shí)(5-25μg)在755nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白質(zhì)的含量。此法的優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可以穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)。進(jìn)行測(cè)定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度的不同選用不同的測(cè)定波長(zhǎng)：若蛋白質(zhì)缺點(diǎn)是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測(cè)定時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗(yàn)消除。此法是在Folin—酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團(tuán)，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin—酚反應(yīng)。此外，所測(cè)的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對(duì)此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對(duì)顯色無影響，這些物質(zhì)在所測(cè)樣品中含量較高時(shí)，則需做校正曲線。若所測(cè)的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉—?dú)溲趸c濃度即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉—?dú)溲趸c濃度1—2倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。缺點(diǎn)是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測(cè)定時(shí)應(yīng)排除干擾因素或做空白試三、實(shí)驗(yàn)材料（一）實(shí)驗(yàn)器材100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；722型分光光度計(jì)。三、實(shí)驗(yàn)材料（二）實(shí)驗(yàn)試劑試劑甲：1)4%碳酸鈉溶液2)0.2mol/L氫氧化鈉溶液3)1%硫酸銅溶液4)2%酒石酸鉀鈉溶液。臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin—酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。（二）實(shí)驗(yàn)試劑試劑乙：稱鎢酸鈉（Na2WO2?2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25g置2000ml磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700ml，85%磷酸50ml和濃硫酸100ml。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶?jī)?nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴。在通風(fēng)櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000ml，過濾即成Folin-酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長(zhǎng)期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當(dāng)溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時(shí)即為滴定終點(diǎn)。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當(dāng)于1mol/L酸度應(yīng)用。試劑乙：（二）標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成150ug/ml蛋白溶液2.待測(cè)蛋白質(zhì)溶液人血清，使用前稀釋100倍。（二）標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液四、實(shí)驗(yàn)操作1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取7支試管，按下表分別加入各試劑試劑

管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(ml)00.10.20.30.40.50.6蒸餾水(ml)1.00.90.80.70.60.50.4Fo1in-酚試劑甲(ml)5555555搖勻，室溫下放置10分鐘Fo1in-酚試劑乙(ml)0.50.50.50.50.50.50.5迅速搖勻，30℃（或室溫20—25℃）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在500nm處比色A500四、實(shí)驗(yàn)操作1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:取7支試管，按下表分別加入各各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號(hào)管為對(duì)照，以光密度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色2.測(cè)定未知樣品：取2支試管，分別準(zhǔn)確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測(cè)定光密度值。2.測(cè)定未知樣品：2.未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定取4支試管，分2組，按下表平行操作：試管編號(hào)試劑處理空白管×2樣品管×2血清稀釋液/ml00.2蒸餾水/ml1.00.8Folin－酚甲試劑/ml5.05.0搖勻，于20—25℃放置10minFolin－酚乙試劑/ml0.50.5迅速搖勻，30℃（或室溫20—25℃）水浴保溫30min，以蒸餾水為空白，在640nm處比色A500

2.未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試管編號(hào)空白管樣品管血清稀釋液/m五、注意事項(xiàng)(1)Folin-酚乙試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而Folin－酚甲試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅－蛋白質(zhì)溶