一.序言二.生物細胞中汞離子的探測。三.學習總結熒光顯微技術在細胞生物學中的應用一.序言1．1研究背景隨著生物研究的發(fā)展，對于超高分辨與高信噪比成像技術的要求越來越高。近年來，共焦熒光顯微術和全內反射熒光顯微術顯示了很好的發(fā)展前景。這兩項光學成像技術在分子生物學、分子化學及納米材料等領域受到了廣泛關注。1．1．1共焦熒光顯微術激光掃描共焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscopeLSCM)是上世紀80年代開始投入實際應用的一種熒光顯微設備。與普通光學顯微鏡相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以對樣品進行分層掃描，實現(xiàn)三維重建和測量分析；與電子顯微鏡相比，LSCM可以在亞細胞水平上觀察諸如ca2+和膜電位等生理信號及活細胞形態(tài)的實時動態(tài)變化。1．1．2全內反射熒光顯微術細胞內含有多種分子機器，涉及細胞運動、DNA轉錄加工、細胞信號轉導、蛋白質合成和蛋白質折疊等多種過程，這些分子機器在活細胞中協(xié)調運作，使細胞功能得到發(fā)揮。傳統(tǒng)的分子和細胞生物學技術已經(jīng)比較深入地闡明了分子機器中生物分子的構成及其所扮演的角色，但是單個分子的活動卻被平均化而觀察不到。迄今為止，在細胞生物學領域所進行的研究，絕大部分是集合平均(ensembleaveraging)效應，而不是單分子研究。熒光單分子檢測技術(singlemoleculedetection)是用熒光標記來顯示和追蹤單個分子的方法。由于熒光信號測量靈敏度高以及光子對分子干擾最輕微，全內反射技術被廣泛應用于單分子研究．尤其對于需觀察細胞內單分子實時變化的細胞生物學研究。全內反射被認為是非常有效的技術。全內反射熒光顯微術成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的最有前途的光學成像技術。現(xiàn)在全內反射熒光顯微術已被廣泛用于實時觀察單個肌漿球蛋白分子的運動、單個蛋白分子對之間的熒光共振能量轉移、ATP酶的翻轉，聚合物內單個分子的結構變化以及等離子體膜附近的神經(jīng)分泌腺的顆粒運動等多方面。

二.微量汞離子的探測2.1微量汞離子的探測.環(huán)境中任何形式的汞均可在一定條件下轉化為劇毒的甲基汞。據(jù)《全球汞狀況評估》的報告中指出人類受汞污染傷害的途徑有很多，但大多數(shù)人是因為食用了被汞污染的魚類和海洋哺乳動物。因而環(huán)境水樣以及生物體中的汞含量測定具有重要意義。目前用于汞的測定方法主要有：原子吸收光譜，x射線分析以及”Hg2+檢測等。這些測量方法雖然都能到達到比較高的靈敏度，但是往往需要昂貴的設備以及大量的樣品。而且其測量是以損害生物體為基礎的，根本沒有辦法做到活體檢測。因此，尋求新的汞探測方法是一個持續(xù)的熱門方向。2．2汞離子的熒光探測方法

近年來還是有很多關于熒光探針的報道。在這些熒光探針中，大部分是通過探針與汞耦合后熒光強度的變化來探測汞．由于其熒光很弱，所以在復雜環(huán)境中，一旦探針分布不均勻，就很難通過熒光強度的變化進行準確的檢測。另外。由于它們中的大部分只能在有機溶劑中探測，很少有可以在水環(huán)境下檢測的探針。所以，這些探針很難用于檢測生物體中的汞污染。再次，由于其本身技術的限制，探測靈敏度都不是很高，約在10-4M附近。因此，尋求一種可以在生物中探測微量汞離子的熒光探針成為了首要目標。2．3汞離子熒光探針BNPTU

本實驗中使用的汞離子熒光探針是由華東理工大學化學系合成的。他們對原先合成的汞離子熒光探針進行改進，取得了具有較高的溶解度和溶解速率以及較大的雙光子吸收截面的新型探針。熒光探針的合成過程以及與汞反應生成的產(chǎn)物如圖2．1所示。圖2．1BNPTU的合成過程以及與汞離子反應以后結構的變化。2．3汞離子熒光探針BNPTU得到的的熒光探針BNTPU比傳統(tǒng)的熒光探針有著明顯的優(yōu)勢：

(1)相對于大部分探針顯示的熒光強度變化而言，BNTPU最大的特點就是在探測汞離子的時候顯示的是光譜位移。由于汞離子的嗜硫性，可以使原來的硫脲基團轉變成半族咪唑，這樣就會缺失很多電子授予基團，因此會帶來大量的熒光團的電子失位的損耗，從而使得BNTPU探測汞離子的時候顯示出顯著的光譜藍移。這樣可以排除溶液濃度變化對熒光強度的影響，在很大程度上避免了由于復雜生物環(huán)境所帶來的濃度分布不均勻引起的測量誤差.(2)BNPTU具有很高的雙光子吸收截面。由于雙光子在生物探測中有著重要的應用，雙光子吸收性質在最近得到極大的重視。雙光子過程在生物應用中有著許多優(yōu)點：它穿透性強：可以得到很好的空間分辨；紅外光激發(fā)可以減少生物損傷：可以有效的避開生物體的自體熒光等等。

(3)用氮烯丙基取代原來的氮丁基，使得BNPTU比原來的熒光探針具有更好的溶解度。BNPTU在乙腈中的溶解度是9x10-4M，在水和乙腈的混合溶液(v／v=l／9)中的溶解度是5×10-5M，而原來化合物的溶解度只有現(xiàn)在的10％。同時，BNPTU在水中的溶解速度也大大的得到了提高，使得它更適用于生物環(huán)境中的應用。(4)靈敏度比其他同類探針有大大提高，可以探測到ppb的水平。(5)具有很高的離