第六章DNA體外重組與重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

DNA體外重組是指目的基因DNA片段與適當(dāng)載體在DNA連接酶的作用下連接形成重組DNA分子的過程。第一節(jié)重組DNA分子的構(gòu)建一、DNA體外重組必須考慮的因素：①實(shí)驗(yàn)步驟簡單易行；②連接效率較高；③選擇載體要易于重組子篩選；

④選擇的連接方式要便于回收插入的外源DNA片段；⑤外源基因必須在表達(dá)載體DNA的啟動(dòng)子控制之下，并置于正確的閱讀框架之中。

二、外源基因片段與載體的連接方式1、黏性末端連接法(黏性末端法)①單酶切黏性末端連接法

優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作簡單，易于回收外源DNA片段。

缺點(diǎn)：a、載體易自身環(huán)化；

b、克隆不定向；c、難插入特定的基因(兩端具有不同酶切位點(diǎn))；d、大片段DNA的重組率較低；e、片段間串聯(lián)連接，給篩選和分析帶來困難。

插入式黏性末端連接法堿性磷酸酶處理線性DNA載體防止載體自身環(huán)化②雙酶切黏性末端連接法(取代式黏性末端連接法)

優(yōu)點(diǎn)：克服單酶切黏性末端連接法的缺點(diǎn)，能定向克隆。但實(shí)驗(yàn)操作煩瑣。

同尾酶黏性末端間連接：產(chǎn)生雜合位點(diǎn)，不易酶切回收插入片段。但在制備載體DNA片段時(shí)不需除去限制酶就可進(jìn)行連接，防止載體的自身環(huán)化。

構(gòu)建基因組文庫常使用同尾酶Sau3AI和BamHI2、平頭末端連接法(平頭末端法)

缺點(diǎn)：①連接效率低；底物濃度高、酶使用濃度高。加低濃度PEG可促進(jìn)連接效率。②不易回收插入DNA片段；③雙向插入；④多拷貝插入(高底物濃度)。3、同聚物加尾連接法(同聚物加尾法、同聚物接尾法)

優(yōu)點(diǎn)：①不易自身環(huán)化；②連接效率較高；③對DNA片段無特殊要求。缺點(diǎn)：①操作繁瑣；

②外源片段難以回收；③不能調(diào)控外源基因的閱讀框架。

4、人工接頭連接法(人工接頭法)①DNA連接子法(連接子法)

應(yīng)注意：a、接受連接子的DNA片段必須是平頭末端；b、廠商提供的連接子有磷酸化和非磷酸化兩種形式，后者在使用前需要用T4噬菌體多核苷酸激酶處理；c、用相應(yīng)的甲基化酶修飾目的DNA片段；d、連接子濃度高，以至連接效率高；e、連接自會串聯(lián)連接，但沒有影響。

優(yōu)點(diǎn)：a、可任意組合；b、可調(diào)節(jié)外塬基因的閱讀框架；c、連接效率高。連接子(linker)：人工合成的含有一種或幾種限制內(nèi)切酶位點(diǎn)的平頭末端雙鏈DNA片段，8~12bp長。②DNA銜接頭法(銜接頭法)銜接頭(adaptor)：人工合成的一端為平頭末端、另一端為某種限制內(nèi)切酶的單鏈黏性末端的DNA片段。連接子除用于DNA體外重組連接外，還用于插入突變。第二節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化(transformation)是指將質(zhì)粒載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程。

轉(zhuǎn)染(transfection)是指將噬菌體載體或病毒載體的重組DNA分子引入受體細(xì)胞的過程。一、重組DNA向細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)入1、感受態(tài)細(xì)胞熱激轉(zhuǎn)化法(化學(xué)轉(zhuǎn)化法?)

感受態(tài)細(xì)胞是指處于能攝入外源DNA的這種生理狀態(tài)的細(xì)胞。導(dǎo)入方式：42℃熱激45~90s

轉(zhuǎn)化效率：105~106轉(zhuǎn)化子/μg2、電擊轉(zhuǎn)化法(高壓電穿孔法)

原理：將受體細(xì)胞置于一個(gè)適當(dāng)?shù)耐饧与妶鲋?，利用高壓脈沖對細(xì)菌細(xì)胞的作用，使細(xì)胞表面形成暫時(shí)性的微孔，質(zhì)粒DNA得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但細(xì)胞不會受到致命傷害，一旦脫離脈沖電場，被擊穿的微孔即可復(fù)原。

影響因素：①電壓大小(300~600V/cm)；②脈沖時(shí)間(20~100ms)；③重組DNA量。

特點(diǎn)：操作簡單，不需制備感受態(tài)細(xì)胞，適用于任何菌株。但需要昂貴的儀器設(shè)備。

轉(zhuǎn)化效率：109~1010轉(zhuǎn)化子/μg

二、外源DNA向真核細(xì)胞轉(zhuǎn)入1、載體介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)移(載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移)病毒載體、質(zhì)粒載體2、外源DNA直接轉(zhuǎn)移(基因直接轉(zhuǎn)移)

①磷酸鈣沉淀法(DNA/磷酸鈣共沉淀法)

原理：DNA溶液與適量的CaCl2溶液混合，再加入一定量的磷酸鹽溶液，逐步生成DNA-磷酸鈣沉淀復(fù)合物。將適量的DNA-磷酸鈣沉淀加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，通過細(xì)胞的胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，然后整合到染色體上，或游離于細(xì)胞質(zhì)中逐漸被降解。

影響因素：a、沉淀中的DNA濃度，加受體DNA可提高轉(zhuǎn)化效率；b、沉淀與細(xì)胞的保溫時(shí)間。

②脂質(zhì)體介導(dǎo)法

脂質(zhì)體是磷脂在水中形成的一種由脂類雙分子層圍成的囊狀脂質(zhì)小泡結(jié)構(gòu)，其大小一般為1~5um。

原理：脂質(zhì)體與細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，便把其攜帶的外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)或進(jìn)入細(xì)胞核，最終實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。

脂質(zhì)體介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到磷酸鈣沉淀法的5~100倍，但比DAEA-葡聚糖法低至少90％。

優(yōu)點(diǎn)：脂質(zhì)體制備程序簡單、可進(jìn)行常規(guī)消毒滅菌、毒性小、包裝容量大以及保護(hù)DNA免受核酸酶的降解等。

缺點(diǎn)：效率低。

③DEAE-葡聚糖法DEAE-葡聚糖是一種高分子多聚陽離子化合物，能與外源DNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過細(xì)胞的胞吞作用使DNA進(jìn)入細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移。④血影細(xì)胞介導(dǎo)法血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲等條件下發(fā)生溶血，使血紅蛋白大量溢