曼陀羅種子萌發(fā)及組織培養(yǎng)條件優(yōu)化

曼陀羅是茄子科的一級(jí)草本植物。它也被稱為醉心花、狗堅(jiān)果、洋金花、楓茄子、萬(wàn)桃花等。具有抗風(fēng)抗?jié)?、止哮喘、定痛的功效，具有很高的藥用價(jià)值。其藥效成分主要為莨菪堿(hyoscyamine)、東莨菪堿(scopolamine)及阿托品(atropine)等托品烷類生物堿類,內(nèi)含的生物活性成分具有抗膽堿特性且活性較高,在醫(yī)學(xué)、戒毒、植保和環(huán)保領(lǐng)域都有廣泛的運(yùn)用,對(duì)多種疾病有很好的治療作用。目前有關(guān)曼陀羅種子萌發(fā)和組織培養(yǎng)的研究,僅見(jiàn)用理化方法處理曼陀羅種子,打破其休眠而提高種子發(fā)芽率、愈傷組織分化及懸浮細(xì)胞再生、用愈傷組織制備原生質(zhì)體等方面。而利用GA3促進(jìn)曼陀羅種子萌發(fā)的時(shí)間和濃度效應(yīng)以及植株再生體系的建立未見(jiàn)系統(tǒng)報(bào)道。曼陀羅種子自然萌發(fā)率低,對(duì)季節(jié)和氣候要求高,建立曼陀羅種子萌發(fā)及植株再生體系,打破曼陀羅生長(zhǎng)和繁殖的環(huán)境限制,為曼陀羅資源開(kāi)發(fā)和市場(chǎng)需求提供重要的技術(shù)保證。1種子萌發(fā)、幼葉發(fā)育曼陀羅種子采于貴州省貴陽(yáng)市藥用植物園,經(jīng)西南大學(xué)孫敏教授鑒定為曼陀羅DaturastramoniumL.,將種子放于4℃冰箱內(nèi)保存3個(gè)月,用GA3處理使種子萌發(fā),待幼苗長(zhǎng)至5cm左右,以幼葉作為外植體。2方法2.1種子處理與播種將種子放于40℃溫水中浸泡1h,然后用自來(lái)水常溫浸泡24h,洗凈后分別用0(CK)、20、40、60mg/L的GA3分別處理1、5、10、15h,將種子播種于裝有濕沙培養(yǎng)皿中,每個(gè)處理30粒種子。每天觀察種子的萌發(fā)數(shù),計(jì)算種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)。2.2組織損傷的誘導(dǎo)和再生體系的構(gòu)建2.2.1瓊脂糖的用量基本培養(yǎng)基為MS,pH5.8,蔗糖30g/L,瓊脂6.5g/L。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃,光照強(qiáng)度1500lx,光照時(shí)間16h/d。2.2.2外植體的消毒處理曼陀羅幼苗經(jīng)自來(lái)水沖洗2h,用75%乙醇和0.1%HgCl2作為消毒劑,使用不同消毒方法消毒后,無(wú)菌水沖洗4~5次后把幼苗剪成1cm左右的外植體,用無(wú)菌濾紙吸干后接種于MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng),光照培養(yǎng)7d后記錄外植體污染數(shù)和存活數(shù)。2.2.3外植體接種方案取無(wú)菌的葉片切成5mm×5mm大小的外植體,采用表1設(shè)計(jì)的方案進(jìn)行試驗(yàn),每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)接種5個(gè)外植體,培養(yǎng)基為MS。4周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率(愈傷組織誘導(dǎo)率=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù))。2.2.4外植體接種方法選取長(zhǎng)勢(shì)較好的愈傷組織,采用L9(34)正交試驗(yàn)表將實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為9組,每組3個(gè)重復(fù),每瓶接種3個(gè)外植體。分別將其接種在附加不同質(zhì)量濃度6-BA、NAA培養(yǎng)基上,30d后統(tǒng)計(jì)生芽率和平均發(fā)芽個(gè)數(shù),并分析試驗(yàn)結(jié)果,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。2.2.5生根情況觀察待叢生芽長(zhǎng)到5~6cm時(shí),剪下生長(zhǎng)健壯的芽體接到MS固體培養(yǎng)基中,每瓶接種3株苗,每個(gè)水平重復(fù)3次,光照培養(yǎng)20d后,觀察其生根情況。選擇生長(zhǎng)健壯的植株,打開(kāi)瓶蓋,室內(nèi)培養(yǎng)3d,洗盡根上殘余的培養(yǎng)基,將小苗移栽于腐殖土和蛭石(5∶2)混合的土壤中溫室培養(yǎng),兩周澆1次不加激素和蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。3結(jié)果與分析3.1不同處理?xiàng)l件對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響GA3可以解除種子的休眠,但不同質(zhì)量濃度的GA3和處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響不同。隨著處理質(zhì)量濃度和時(shí)間的增加,發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)都先升高后降低。質(zhì)量濃度為60mg/L和處理時(shí)間為10h時(shí),種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)最高,發(fā)芽率達(dá)73.33%,發(fā)芽勢(shì)達(dá)4.58%。所以,用60mg/LGA3處理10h時(shí)種子萌發(fā)效果最好(圖1)。3.2深入殺菌力適當(dāng)?shù)南緯r(shí)間對(duì)獲得無(wú)菌的外植體很重要,70%~75%的乙醇具有較強(qiáng)的浸透力和殺菌力。結(jié)果見(jiàn)表3,外植體經(jīng)75%乙醇處理15s后再用0.1%HgCl2浸泡3min后獲得的無(wú)菌曼陀羅外植體具有較高的存活率,存活率達(dá)到70.59%,污染率較小,效果最佳。3.3結(jié)果表1將無(wú)菌葉片接種到培養(yǎng)基中約7d后,葉片周圍出現(xiàn)了少量較致密的淺黃色愈傷組織,隨時(shí)間的延長(zhǎng),愈傷組織體積迅速增加(圖2-A)。愈傷組織的誘導(dǎo)率和培養(yǎng)基中所含激素的濃度有關(guān),結(jié)果見(jiàn)表4。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí),愈傷誘導(dǎo)率隨NAA質(zhì)量濃度升高而增大,在0.1mg/L時(shí)愈傷分化最高;當(dāng)NAA質(zhì)量濃度一定時(shí),隨6-BA質(zhì)量濃度的升高,愈傷組織誘導(dǎo)率先升高再降低,在0.5mg/L時(shí)分化最高。所以誘導(dǎo)愈傷組織最佳的培養(yǎng)條件為MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA,誘導(dǎo)率達(dá)92.5%。結(jié)果表明,在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程中,不但需要控制植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量濃度,而且應(yīng)當(dāng)控制生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比。在脫分化過(guò)程中,生長(zhǎng)素起主要作用,但與一定質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素配比,效果會(huì)更好。3.4叢生芽的誘導(dǎo)選擇生長(zhǎng)良好的愈傷組織,接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后,傷口處膨大并長(zhǎng)出許多綠色突起,隨后小突起進(jìn)一步膨大成叢生芽的芽點(diǎn),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),約30d后形成簇生綠色叢生芽(圖2-B)。第4組叢生芽的誘導(dǎo)率最高,為94.5%,平均發(fā)芽數(shù)17.78個(gè),NAA和6-BA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果的影響不顯著(P>0.05),叢生芽誘導(dǎo)結(jié)果見(jiàn)表5。極差分析表明影響曼陀羅叢生芽誘導(dǎo)因素依次為6-BA>NAA>MS,6-BA對(duì)叢生芽的形成影響較大,誘導(dǎo)叢生芽的最優(yōu)組合為A2B1C1,即MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。3.5曼陀羅幼根的誘導(dǎo)表達(dá)芽長(zhǎng)至3~5cm時(shí),將叢生芽切成單芽,轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。芽苗在轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8d之后小芽基部開(kāi)始有白色突起形成,約15d培養(yǎng)基中長(zhǎng)出較多的根,植株生長(zhǎng)健壯,發(fā)育良好(圖2-C、D)。曼陀羅是熱帶陽(yáng)生植物,對(duì)光的依賴性較強(qiáng)。組織培養(yǎng)所得曼陀羅幼苗比較脆弱,移栽過(guò)程中環(huán)境相對(duì)濕度過(guò)高時(shí),根易染菌而死亡。組培苗經(jīng)過(guò)馴化后,移栽到室外的成活率較高,可達(dá)80%以上,植株生長(zhǎng)正常(圖2-E)。4消毒方法的選擇在種子萌發(fā)過(guò)程中,要使種子快速萌發(fā)須破除種子的正常休眠,破除休眠有很多方法,如采用GA3、NaOH處理等,種子的破眠難易程度與種后熟存放時(shí)間長(zhǎng)短有很大聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)表明曼陀羅種子經(jīng)GA3破眠處理后種子萌發(fā)率顯著提高。另外在對(duì)種子進(jìn)行破眠處理前用35℃溫水浸泡2h預(yù)處理后再用GA3破除休眠,比單獨(dú)使用GA3處理種子更好。組織培養(yǎng)過(guò)程中,獲得無(wú)菌外植體是建立植株再生體系的基礎(chǔ),因此消毒劑和消毒方法的選擇尤為重要。75%的乙醇具有很強(qiáng)的浸透力和殺菌力,適當(dāng)?shù)南緯r(shí)間對(duì)獲得無(wú)菌外植體也很重要。要特別注意的是,用HgCl2對(duì)植物材料消毒后要用無(wú)菌水反復(fù)沖洗,洗凈外植體上殘留的重金屬汞,避免汞對(duì)培養(yǎng)物產(chǎn)生進(jìn)一步的毒害作用。在誘導(dǎo)愈傷組織和叢芽時(shí),激素的配比極為關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)曼陀羅愈傷組織時(shí),生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比值相對(duì)大,有利于愈傷