第四章蛋白質(zhì)聚糖的相互作用關(guān)鋒第四章蛋白質(zhì)聚糖的相互作用關(guān)鋒1歷史背景有關(guān)聚糖-蛋白質(zhì)相互作用的許多早期工作都是圍繞酶對聚糖的識別展開的，如糖原和淀粉的合酶和磷酸化酶。Fleming、Chain和Florey因發(fā)現(xiàn)溶菌酶和青霉素的抗菌作用而獲得1945年諾貝爾獎。歷史背景有關(guān)聚糖-蛋白質(zhì)相互作用的許多早期工作都是圍繞酶對聚2溶菌酶-內(nèi)切糖苷酶，專一裂解肽聚糖中的β1-4鍵。溶菌酶-內(nèi)切糖苷酶，專一裂解肽聚糖中的β1-4鍵。3盧伊斯·弗德里科·萊洛伊爾（LuisFedericoLeloir)研究了糖核苷酸及其在碳水化合物合成中的作用(復(fù)雜的糖類分解為簡單碳水化合物的過程)而獲1970年諾貝爾化學(xué)獎盧伊斯·弗德里科·萊洛伊爾（LuisFedericoLe420世紀60年代末，Phillips及其同事們從溶菌酶與四糖形成的復(fù)合物中獲得了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)。20世紀60年代末，Phillips及其同事們從溶菌酶與四糖5ConA1972年和1981年分別報道聚糖結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)和流感病毒血凝素的晶體結(jié)構(gòu)。Lemieux及其同事在凝集素和抗體與特異血型抗原的結(jié)合位點研究中，獲得了促進該領(lǐng)域發(fā)展的關(guān)鍵信息。ConA1972年和1981年分別報道聚糖結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)6蛋白質(zhì)對聚糖的識別蛋白和聚糖的結(jié)合力和任何配體與受體之間的結(jié)合力，包括：氫鍵，范德華力，電荷以及偶極吸引力都是一樣的。蛋白質(zhì)對聚糖的識別蛋白和聚糖的結(jié)合力和任何配體與受體之間的結(jié)7“水問題”大多數(shù)為研究聚糖-蛋白質(zhì)結(jié)合能量學(xué)的嘗試都集中在計算單一的參與因子，譬如測定配體的優(yōu)勢構(gòu)象，或估測聚糖與蛋白質(zhì)結(jié)合位點中功能基團間近程相互作用等?！八畣栴}”大多數(shù)為研究聚糖-蛋白質(zhì)結(jié)合能量學(xué)的嘗試都集中在計8聚糖-蛋白質(zhì)在水中的結(jié)合引起水分子移位的示意圖。聚糖-蛋白質(zhì)在水中的結(jié)合引起水分子移位的示意圖。9從熵值來看，溶劑化/去溶劑化的能量很大，對糖這樣一類化合物很難準確地計算。因此盡管結(jié)合位點是以范德華力和氫鍵相互作用，能量貢獻可以估測，但因估測參與溶劑化反應(yīng)變化的誤差可能很大，給結(jié)合能量的整體計算帶來了困難，這就是“水問題”造成的。從熵值來看，溶劑化/去溶劑化的能量很大，對糖這樣一類化合物很10霍亂毒素與GM1五糖結(jié)合的原子細節(jié)利用X射線晶體學(xué)解析了與蛋白質(zhì)結(jié)合的聚糖表面的一種共有性結(jié)合模式，即約300-400?2，相當于2.5個糖殘基與蛋白質(zhì)接觸?；魜y毒素與GM1五糖結(jié)合的原子細節(jié)利用X射線晶體學(xué)解析11GM1結(jié)構(gòu)GM1結(jié)構(gòu)12結(jié)合霍亂毒素GM1五糖的簡化結(jié)構(gòu)圖中示出了霍亂毒素直接或通過水分子氫鍵與聚糖接觸的氨基酸殘基。結(jié)合霍亂毒素GM1五糖的簡化結(jié)構(gòu)圖中示出了霍亂毒素直接或通過13聚糖-蛋白質(zhì)相互作用的動力學(xué)除界定聚糖結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)外，界定其與各種聚糖的特異性相互作用也很重要。一種凝聚素（L）或抗體（G）的結(jié)合服從簡單的方程式4.1。其中親和常數(shù)K由方程式4.2定義為結(jié)合常數(shù)，因此K也等于k1/k2,K與在pH7進行的結(jié)合反應(yīng)標準自由能變化ΔG0(4.3)有關(guān)。

4.14.24.3聚糖-蛋白質(zhì)相互作用的動力學(xué)除界定聚糖結(jié)合蛋白質(zhì)三維結(jié)14其中R為氣體常數(shù)0.00198kcal/mol-度，T是絕對溫度298°K。親和常數(shù)K也與方程式4.4中熱力學(xué)參數(shù)有關(guān)，其中ΔG、ΔH和ΔS各自代表結(jié)合反應(yīng)的自由能、焓和熵的變化。

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK其中R為氣體常數(shù)0.00198kcal/mol-度，T是絕對15顯然，對每一項研究中特定的結(jié)合現(xiàn)象，有必要界定其K、k1、k2、ΔG、ΔH和ΔS參數(shù)，但研究者們往往只簡單地設(shè)法界定K常數(shù)。研究聚糖和蛋白質(zhì)結(jié)合有多種不同方法，從熱力學(xué)的嚴格性、聚糖和蛋白質(zhì)的用量以及分析速度各方面比較，每一種方法均有其長處和不足。顯然，對每一項研究中特定的結(jié)合現(xiàn)象，有必要界定其K、k1、k16X-射線衍射和核磁共振核磁共振是測定溶液中生物分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)選方法。一般來說，單糖是既小而又較剛性的分子，但組裝起來的聚糖，由于其圍繞糖苷鍵的選裝自由度而具有較大的柔性。在核磁共振中，應(yīng)用多維技術(shù)如NOE

（NuclearOverhauserEffect），遵從質(zhì)子共振的分配能夠預(yù)測出質(zhì)子-質(zhì)子間的距離，這一信息再與計算機數(shù)學(xué)建模的計算技術(shù)相結(jié)合，便可預(yù)測出游離態(tài)寡糖在溶液中的構(gòu)象，應(yīng)用轉(zhuǎn)移NOE有可能把這種信息推廣用于測定聚糖與蛋白質(zhì)在溶液中的相互作用。X-射線衍射和核磁共振核磁共振是測定溶液中生物分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)選17平衡透析平衡透析方法是將聚糖結(jié)合蛋白濃溶液(凝集素和抗體)放入可滲透到配體（聚糖或小分子半抗原）的透析室，然后把透析室置入已知體積的含有濃度范圍為1/K的聚糖緩沖液中平衡，在平衡狀態(tài)下，結(jié)合的聚糖濃度加上袋內(nèi)游離聚糖濃度（In）和袋外游離聚糖的濃度(Out)將取決于袋內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度和親和力，由此可測定聚糖-蛋白質(zhì)之間的相互作用。平衡透析平衡透析方法是將聚糖結(jié)合蛋白濃溶液(凝集素和抗體)放18優(yōu)點：

1.方法簡單，不需精密儀器。

2.高親和力情況下，蛋白需求量小。

3.高親和力情況下，所需半抗原也少。

4.蛋白質(zhì)和抗原均很穩(wěn)定時，可回收重復(fù)利用。

5.可應(yīng)用具有放射活性的半抗原。

6.平衡測定結(jié)果可靠。缺點：

1.只能得出K（結(jié)合常數(shù)）值。

2.低親和力時，蛋白質(zhì)和半抗原需要量較大。

3.要做多次不同的測定，耗時較長。優(yōu)點：19親和層析親和層析是將凝聚素固定到一種親和載體上（如Affi-GelTM），將含有聚糖的緩沖液加入固定的凝聚素中，根據(jù)洗脫譜型測定與凝聚素的結(jié)合。如果聚糖與固定的凝聚素結(jié)合相對牢固，可加入含有某種已知半抗原緩沖液使復(fù)合物解離，在這種情況下，可以估定凝聚素的結(jié)合特異性及其近似的結(jié)合親和力，因為固定化凝聚素的濃度是已知的，其結(jié)合容量也可以界定。親和層析親和層析是將凝聚素固定到一種親和載體上（如Affi-20一種更為精細的方法是前沿親和色譜分析法，是將含有已知濃度的聚糖樣品加到固定了聚糖結(jié)合蛋白的柱上，監(jiān)測從層析柱中洗脫下來的聚糖（洗脫前沿）。為此，持續(xù)地將配體加到柱上，也就是當配體開始在洗脫液中出現(xiàn)時，代表洗脫前沿的體積即為配體結(jié)合親和力的一次度量。

一種更為精細的方法是前沿親和色譜分析法，是將含有已知21Vf[T]/Vt為柱的結(jié)合容量；Vf為前沿體積；Vt為層析柱的總體積；[O]為所添加溶液中聚糖的濃度；[L]為基質(zhì)中凝集素濃度。用不同的聚糖濃度可得到一系列洗脫曲線圖，并可得出50%的飽和點。Vf[T]/Vt為柱的結(jié)合容量；Vf為前沿體積；Vt為層析柱22親和層析舉例，圖中表示用不同濃度的聚糖上樣于固定化凝聚素層析柱。最低濃度時（D），聚糖洗脫延遲，層析前沿用垂直線表示。濃度漸增（C→A），聚糖提前洗脫。親和層析舉例，圖中表示用不同濃度的聚糖上樣于固定化凝聚素層析23滴定量熱法可用商品微量熱量儀，以等溫滴定量熱法測定自由能變化進行聚糖與凝聚素結(jié)合的研究。具體：用一注射器將含有測試聚糖的溶液加到微量熱儀混合池中含固定濃度凝聚素的溶液內(nèi)。加到對照實驗混合池內(nèi)的溶液不含蛋白質(zhì)。按一定時間間隔，分多次加入1-3ul的聚糖溶液，測量由結(jié)合反應(yīng)釋放出的熱量，然后作圖分析。滴定量熱法可用商品微量熱量儀，以等溫滴定量熱法測定自由能變化24優(yōu)點:提供有關(guān)聚糖結(jié)合到聚糖結(jié)合蛋白上的所有重要熱力學(xué)數(shù)據(jù)，遠遠優(yōu)于平衡層析和親和層析方法。缺點:

1.蛋白質(zhì)用量較大。

2.聚糖用量也大。

3.這類分析方法不能有代表性地利用范圍廣泛的不同的聚糖。優(yōu)點:25表面激元共振表面激元共振（SPR）是由某種游離分子（分析物）與傳感器芯片上固定的配體相結(jié)合而引發(fā)芯片表面折射率變化的一種技術(shù)。這一方法是測定表面層的折射率變化，并記錄為SPR信號或共振單位（RU）。表面激元共振表面激元共振（SPR）是由某種游離分子（分析物）26SPR方法中，對分析物與固定配體結(jié)合引發(fā)的反射光變化及其測定。SPR方法中，對分析物與固定配體結(jié)合引發(fā)的反射光變化及其測定27優(yōu)點：

1.可測定從mmol到pmol范圍的親和力。

2.可常規(guī)進行k1和k2（方程式4.1）的全測定。

3.對于采用氨基偶聯(lián)分子的固定化，正常情況下用量很少。

4.測定速度快，全部實驗結(jié)果可在幾天內(nèi)完成。缺點：

1.要求分析物要有足夠大的質(zhì)量（>2