食用真菌斑玉孢凝集素的分離純化及性質(zhì)研究

凝收集素在自然界分布廣泛，具有許多生物學性質(zhì)（孫石等人，1986）。在科學研究領(lǐng)域，它的應(yīng)用越來越廣泛。為了深入研究已知的凝收集素，一些國家的科學家在廣泛研究改進后，也將新的凝收集素作為主要研究方向。由于食用真菌含有多種生理活性物質(zhì),從食用真菌子實體或菌絲體中分離到的多糖類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)寄主的免疫活性和抗腫瘤作用,而凝集素則是食用真菌的另一類生理活性物質(zhì),有著重要的醫(yī)學和生物學功能。但有關(guān)食用真菌凝集素研究報道不多,有些食用真菌凝集素具有較強的抗腫瘤活性,如口蘑凝集素(Wangetal.1997)、金針菇凝集素(Koetal.1995)、楊樹菇凝集素(孫慧等,2003)等。因此,對食用真菌凝集素深入研究,可望為其深層次的開發(fā)利用提供一條新的途徑。斑玉蕈又稱真姬菌(日本)、蟹味菇,學名Hypsizygusmarmoreus,隸屬擔子菌綱、傘菌目、白菇科、玉蕈屬,是一種食、藥兼用菌。斑玉蕈菇形怡人,質(zhì)地脆嫩,子實體營養(yǎng)豐富,且因具有獨特的蟹鮮味而著名。斑玉蕈的研究多見栽培和營養(yǎng)價值方面的報道,其生理活性物質(zhì)的研究甚少,有關(guān)斑玉蕈凝集素的研究,至今尚未見到報道。我們曾經(jīng)對植物凝集素(林玉滿,1995)和食用真菌長裙竹蓀凝集素(林玉滿和蘇愛華,2003)進行了研究,在對食用真菌生理活性物質(zhì)的研究過程中,發(fā)現(xiàn)斑玉蕈子實體中存在著能凝集兔紅細胞的凝集素。本文報道從斑玉蕈子實體中提取分離純化凝集素,并對其部分性質(zhì)和細胞凝集活性進行研究。1材料和方法1.1低分子量標準蛋白試劑盒新鮮斑玉蕈子實體購自福建福州。兔由福建醫(yī)科大學提供,人血由福建師大醫(yī)院提供,雞購自農(nóng)貿(mào)市場;低分子量標準蛋白試劑盒和SephadexG-100為Pharmacia公司產(chǎn)品;AmpholinepH3.5～10等其它等電聚焦電泳均采用LKB產(chǎn)品;N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖為Sigma公司產(chǎn)品,其它糖為國產(chǎn)分析純或生化試劑,其余試劑為分析純。1.2方法1.2.1家兔紅細胞及內(nèi)、外透析新鮮斑玉蕈子實體洗凈,用帶冷卻水的高速搗碎機勻漿,加生理鹽水抽提,紗布過慮,4℃離心(5000r/mim,30min),上清液以30～60%飽和度硫酸銨沉淀,經(jīng)測定,僅沉淀物對兔紅細胞具有血凝活性。該沉淀物溶于PBS(0.05mol/Lx7f磷酸緩沖液-0.15mol/LNaCl,pH7.2),并對同一緩沖液透析至外透析液無SO42-x7f檢出后,上DEAE-Cellulose(1.6cm×40cm)柱,PBS洗脫,分管收集。采用LKB柱層析系統(tǒng)自動檢測,檢測波長為278nm,根據(jù)檢測儀自動記錄的各洗脫峰,用兔紅細胞檢測各峰的血凝活性?；钚圆糠纸?jīng)SephadexG-100柱(2.6cm×60cm)進一步純化,洗脫液仍為PBS,分管收集,同法檢測,收集活性部分的洗脫液,經(jīng)蒸餾水透析去鹽,冷凍干燥,得HML純品。1.2.2tis-甘氨酸緩沖液/ph電泳用聚丙烯酰胺電泳法測定。按吳鶴齡和林錦湖(1984)方法,在Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)中進行電泳,凝膠濃度為7.5%。電泳后凝膠條分別以考馬斯亮藍R-250和高碘酸─Schiff試劑染色。1.2.3亞基分子量weber-5,6相對分子質(zhì)量測定:采用SephadexG-100凝膠過濾法。分子量標準蛋白質(zhì)為:牛血清白蛋白(67×103)、卵清蛋白(43×103)、胰凝乳蛋白酶原(25×103)和核糖核酸酶(13.7×103),以標準蛋白的分子量對Kav(有效分配系數(shù))作圖,繪制標準曲線,根據(jù)HML的Kav,求得HML的分子量。亞基相對分子質(zhì)量測定:按Laemmli(1970)方法,采用1%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳,凝膠濃度為7.5%,內(nèi)含巰基乙醇,考馬斯亮藍R-250染色。所用標準蛋白為磷酸化酶b(94×103)、牛血清白蛋白(67×103)、卵清蛋白(43×103)、碳酸酐酶(30×103)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20.1×103)和α─乳清蛋白(14.4×103)。根據(jù)標準蛋白質(zhì)和凝集素的遷移率,按Weber的方法求得亞基分子量(Weber&Osborn,1969)。糖含量測定:按Ashwell(1966)的濃硫酸─苯酚法進行測定。氨基酸組成分析:由國家醫(yī)藥管理局福建省微生物研究所測定。將HML用6mol/LHCl于110℃水解24h,在HITACH835-50型氨基酸自動分析儀上測定。等電點測定:采用等電聚焦電泳測HML的等電點。測定方法參照LKB公司生產(chǎn)的多用電泳儀的操作手冊,Ampholine的pH范圍為3.5～10,凝膠濃度為4.8%,采用表面電極測定膠板的pH值。糖肽鍵特征分析:按戈蘇國等(1983)的方法測定。將HML置于0.2mol/L的NaOH水溶液中,于45℃保溫2h,測定溶液的紫外吸收光譜,同時測定未經(jīng)堿處理的相同濃度樣品的紫外吸收光譜,比較處理前后光譜變化。1.2.4不同因素對兔紅細胞的凝集活性的影響血凝活性測定:在人血和動物血的血樣中,加入Alsever抗凝劑,離心去除血漿,血球用生理鹽水洗滌3～5次,最后配成2%細胞懸液。參照孫冊等(1986)方法測定,在“V”型血凝板上,取25μL凝集素溶液與等量的PBS作倍比稀釋,然后加25μL2%的兔紅細胞,振蕩后室溫放置2h,肉眼或顯微鏡觀察結(jié)果。人的A、B、AB和O型血紅細胞和其它動物的血紅細胞凝集作用測定方法與孫冊等(1986)測定方法相同。溫度對細胞凝集活性的影響:將濃度為600μg/mL的樣品分成若干份,在每個帶蓋的小試管中分別加入上述溶液150μL,在恒溫水浴鍋里,于30～100℃之間,每隔10℃將一個樣品保溫熱處理10分鐘,取出后立即用流水冷卻至室溫,隨后在“V”型血凝板上測定其對兔紅細胞血凝活性。同時與室溫(20℃)樣品對照。pH對細胞凝集活性的影響:參照Ahmed&Chatterjee方法(1989),配制pH3.0～10.8的系列緩沖液。pH3.0～6.0,采用0.1mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液;pH7.0～8.0,采用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液;pH9.0～10.0,采用0.05mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液;pH10.8,采用0.1mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。分別用上述緩沖液將HML配成濃度為600μg/mL溶液,凝集試驗按常規(guī)操作在“V”型血凝板上進行,每孔加入25μL緩沖液(每排的pH不同),第一孔加入25μLHML溶液,混勻后依次倍比稀釋,然后加25μL2%的兔紅細胞,振蕩后室溫放置2h,觀察結(jié)果。糖對細胞凝集活性的影響:參照孫冊等(1986)方法測定。各種糖濃度配成0.2mol/L,按照凝血活性測定法,在“V”型血凝板上,糖溶液依次倍比稀釋,然后各孔加HML,每孔所加的凝集素量(在此凝集素濃度為紅細胞產(chǎn)生50%凝集)相同,最后加2%新鮮兔紅細胞,振蕩后室溫放置2h,觀察其對兔紅細胞凝集活性影響結(jié)果。2結(jié)果與討論2.1ph-100柱的制備斑玉蕈子實體經(jīng)生理鹽水抽提、硫酸銨沉淀,得到凝集素粗品。該粗品經(jīng)DEAE-Cellulose柱層析,得到4個洗脫峰,經(jīng)血凝活性測定,第2個洗脫峰具有高的血凝活性。將第2個洗脫峰的洗脫液,用SephadexG-100柱進一步純化,得到2個洗脫峰(圖1),經(jīng)血凝活性測定,第1峰具有血凝活性,第2峰則無活性。收集第1洗脫峰的洗脫液,透析去鹽,冷凍干燥,得到斑玉蕈凝集素純品HML。2.2單一色,單一色HML經(jīng)聚丙烯酰胺電泳,凝膠條用考馬斯亮藍染色,呈現(xiàn)出單一色帶;高碘酸-Schiff試劑進行糖蛋白染色也呈出單一色帶,且兩單一色帶泳動距離相同,結(jié)果顯示所得到的樣品為電泳純品。2.3ml的各種性能2.3.1相對分子質(zhì)量kHML經(jīng)SephadexG-100凝膠過濾,呈現(xiàn)單一對稱的洗脫峰,根據(jù)標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量,求得凝集素HML的相對分子質(zhì)量為35kD;經(jīng)1%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)果見圖2,按Weber方法,從標準蛋白的標準曲線上求得HML的亞基相對分子質(zhì)量為34.2kD,這與分子篩層析的結(jié)果基本相符,說明該凝集素可能由一個亞基組成。2.3.2測定中性糖含量2.3.3氨基酸組成分析HML酸水解的氨基酸測定結(jié)果見表1。從表1可知,該凝集素含有17種氨基酸。2.3.4等電點hm測量HML經(jīng)等電聚焦電泳,顯示單條蛋白染色帶,經(jīng)測定,其pI為8.15。2.3.5糖鏈粘連—HML糖肽鍵特征分析:由于O-型糖肽鍵對堿不穩(wěn)定,在稀堿溶液的作用發(fā)生了β-消去反應(yīng),在糖肽連接處,與糖鏈連結(jié)的絲氨酸生成α-氨基丙烯酸,蘇氨酸生成α-氨基丁烯酸,形成的這兩種不飽和氨基酸在240nm處均有特征紫外吸收。HML經(jīng)堿處理后在240nm處的紫外吸收與堿處理前相比有著明顯的增加(圖3),這說明了HML中的糖肽鍵為O-型糖肽鍵。2.4hml細胞凝集活性分析2.4.1凝集反應(yīng)與血凝作用不一詞,均有型化的基因機HML初始濃度配成600μg/mL,經(jīng)倍比稀釋后測定其對人血和動物血紅細胞的凝集活性(表2),結(jié)果表明,HML對兔、雞、蛙的紅細胞、人的A、B、AB和O型血紅細胞均能發(fā)生凝集反應(yīng),其血凝作用不具有人血型專一性。對被測的不同血紅細胞的凝集強度顯示差異,對兔紅細胞的凝集作用最強,凝集反應(yīng)的最低濃度為2.35μg/mL,對雞紅細胞的凝集作用最弱,凝集反應(yīng)的最低濃度為37.5μg/mL,而對人的A、B和O型血紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)的最低濃度為9.38μg/mL,對AB型則為18.75μg/mL。2.4.2不同溫度對hml血凝活性的影響HML的初始濃度為600μg/mL,經(jīng)熱處理后,在“V”型血凝板上經(jīng)倍比稀釋,測定不同溫度對HML血凝活性的影響,結(jié)果如表3所示。表3表明,HML的血凝活性在40℃以下穩(wěn)定,50℃時僅有部分活性,60℃活性則完全消失。由此可見,HML對熱較不穩(wěn)定。2.4.3細胞凝集活性在pH3.0～10.8的條件下,測定了HML的血細胞凝集活性,結(jié)果如表4所示。表4表明,在pH5.0～8.0,HML的細胞凝集活性較高,pH10.0起,凝集活性則完全消失,即其對堿較不穩(wěn)定。2.4.4巖藻糖和n-乙酰半乳糖胺凝集活性測定斑玉蕈子實體凝集素的糖抑制實驗結(jié)果如表5所示。從表5可知,HML對兔紅細胞的凝集活性可被甘露糖、半乳糖、巖藻糖和N-乙酰半乳糖胺所抑制,其最低抑制濃度分別為50mmol/L、12.5mmol/L、100mmol/L和50mmol/L,而