炎癥性腸病與腸道淋巴細(xì)胞歸巢研究進(jìn)展

0腸道細(xì)胞回復(fù)突變試驗(yàn)20世紀(jì)60年代，桂克斯和keel從正常大鼠的輸出淋巴管中分離淋巴結(jié)，注入受體動物的血循環(huán)，然后通過光線成像和輻射自變成像來觀察這些細(xì)胞的分布。觀察到，這些細(xì)胞的分布在全身的二級淋巴結(jié)組織中，激活的免疫母細(xì)胞選擇性地轉(zhuǎn)移到粘膜部位。受實(shí)驗(yàn)啟發(fā)，許多科學(xué)家進(jìn)行了一系列生物研究。這些實(shí)驗(yàn)為i級細(xì)胞疾病的形成和回歸奠定了基礎(chǔ)。現(xiàn)在，已經(jīng)證明，炎癥（ibd）的發(fā)生與易感細(xì)胞的異常免疫反應(yīng)有關(guān)。雙殼類動物（lh）作為免疫反應(yīng)的一個重要組成部分，在預(yù)防和復(fù)發(fā)缺陷疾病方面發(fā)揮著重要作用。1lh.lh的分子基礎(chǔ)成熟淋巴細(xì)胞離開中樞免疫器官后,經(jīng)血液循環(huán)趨向性遷移并定居于外周免疫器官或組織特定區(qū)域,稱為LH.LH的分子基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的相互作用.介導(dǎo)LH的黏附分子稱為淋巴細(xì)胞歸巢受體(lymphocytehomingreceptor),其相應(yīng)配體為血管地址素(vscularaddressin),主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面.2趨化因子的激活淋巴細(xì)胞從循環(huán)募集到目標(biāo)組織是一個高度調(diào)節(jié)的過程,依賴一系列黏附分子的相繼作用.需經(jīng)歷貼壁,滾動(rolling);趨化因子對整合素的激活(activing);整合素介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞牢固黏附(adhereing);淋巴細(xì)胞于高內(nèi)皮靜脈(highendothelialvenules,HEV)內(nèi)皮細(xì)胞間隙的游出該過程涉及到一系列歸巢受體、地址素及趨化因子的級聯(lián)作用.各亞群的具體歸巢步驟有所不同.2.2地址素2.3尋求因素3炎癥性腸病中淋巴結(jié)回歸3.1巴基斯坦3.1.1th1型免疫反應(yīng)大量的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型都表現(xiàn)為Th型炎癥,其炎癥特征在肉眼和光鏡水平下均和CD相似.研究的較多的有三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonicacid,TNBS)結(jié)腸炎和IL-10基因敲除小鼠發(fā)生的結(jié)腸炎.IL-10是Th2型反應(yīng)的促進(jìn)因子,Th1型反應(yīng)的抑制因子.通過動物試驗(yàn)技術(shù)把編碼IL-10的基因敲除后,小鼠可自發(fā)腸道炎癥,病變以直腸和結(jié)腸為主,病理學(xué)特征與人類CD十分相似,炎癥部位T浸潤分泌高水平IFN-γ和TNF-α,表現(xiàn)為顯著的Th1型免疫反應(yīng).IFN-γ是Thl型炎癥的關(guān)鍵因子,其產(chǎn)生過度主要與兩個分子有關(guān),一個為T-bet,另一個為STAT4(signaltransducerandactivatoroftranscription4).Furutaetal比較同一遺傳背景下T-bet(-/-)、STAT4(-/-)及T-bet(-/-)和STAT4(-/-)小鼠發(fā)現(xiàn),單獨(dú)敲除T-bet或STAT4基因,Th1型反應(yīng)均顯著降低,若同時敲除兩基因,則幾乎檢測不到Th1型反應(yīng).Thieuetal發(fā)現(xiàn)T-bet促進(jìn)Th1型分化,需要STAT4的參與.有學(xué)者報道CD患者表達(dá)特征性受體IL-12Rβ2的Th1細(xì)胞數(shù)量顯著增加,炎癥組織中的T細(xì)胞的核提取物中的STAT4和T-bet含量也顯著增加.從目前資料來看,UC類似于一種緩和的Th2型免疫反應(yīng),Th2介導(dǎo)的B細(xì)胞激活的證據(jù)是自身抗體的出現(xiàn),包括核旁型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(perinuclearantineutrophicytoplasmaticantibodies,pANCA)和抗IgG1、IgG4亞類抗體.最近有研究發(fā)現(xiàn),IL-13在UC的發(fā)病中起重要作用,可影響腸道上皮細(xì)胞的緊密連接、凋亡和再生.3.1.2t細(xì)胞在各組小鼠腸道炎中的表達(dá)不同于CD4+T細(xì)胞促炎作用,γδT細(xì)胞在IBD的發(fā)生和發(fā)展過程中起保護(hù)調(diào)節(jié)作用,其一般均為CD8αα+.Inagaki-Oharaetal報道γδT基因敲除小鼠能自發(fā)結(jié)腸炎,其幼鼠表顯出對TNBS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的高度敏感性.Hoffmannetal把提取自野生型或IL-10轉(zhuǎn)基因小鼠的γδT細(xì)胞,預(yù)防性轉(zhuǎn)移至同類系TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠,發(fā)現(xiàn)TNBS小鼠腸道和脾臟淋巴細(xì)胞分泌TNF-α減少,IL-10和TGF-β增加,從而使小鼠生存時間延長,組織損傷減輕.Kühletal研究了在多種IBD動物模型中刪除或敲除γδT,發(fā)現(xiàn)早期干預(yù)使黏膜固有層中淋巴細(xì)胞及脾細(xì)胞IFN-γ分泌增加,提示γδT細(xì)胞在腸道炎癥的早期發(fā)揮重要作用,可能的機(jī)制是影響IFN-γ分泌和上皮細(xì)胞再生.另有研究表明γδT細(xì)胞是細(xì)胞因子Th17的重要來源,有細(xì)菌感染時,可快速誘導(dǎo)Th17型反應(yīng),保護(hù)腸黏膜.3.2相關(guān)分子與lh相關(guān)3.2.1發(fā)揮整合素和madcam-1表達(dá)Souzaetal以激惹性腸炎為對照組,通過內(nèi)窺鏡及經(jīng)口空腸活檢取得CD和UC患者的結(jié)腸和空腸標(biāo)本后,做免疫組織染色并用計算機(jī)軟件分析圖像,發(fā)現(xiàn)IBD患者α4β7整合素和MAdCAM-1表達(dá)水平顯著增加;日本學(xué)者Arihiroetal等收集CD(40例)和UC(24例)手術(shù)切除標(biāo)本作冰凍切片,用免疫組化技術(shù)分析也發(fā)現(xiàn)CD和UC炎癥部位的黏膜中MAdCAM-1陽性血管含量增加.3.2.2icam-13.2.3尋求性因素3.3樹突狀細(xì)胞3.4IBD中的白細(xì)胞募集4影響因素：lh在intd中多種因素可通過作用于歸巢受體、地址素等黏附分子的表達(dá),從而影響腸道淋巴細(xì)胞的歸巢進(jìn)而影響IBD的病理和轉(zhuǎn)歸.4.1一些酶活性物質(zhì)4.2細(xì)胞因子4.3維生素d的衍生物4.4微生態(tài)制劑4.5超氧化物誘導(dǎo)酶5抗il-12和抗il-6治療從CD的炎癥環(huán)境可知針對Th1的細(xì)胞因子的抑制治療是有益的.抗TNF的單抗英夫利昔(infliximab)在兩個關(guān)鍵的臨床實(shí)驗(yàn)中,已證明對CD患者有效并被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床然而抗TNF-α的治療在UC中療效較差,這進(jìn)一步突出了理解UC和CD之間不同的免疫病理機(jī)制的重要性.其他一些作用于TNF的藥物如CDP571、依那西普(etanercept)也在臨床評估中其中CDP571對CD的效果與英夫利昔相似,而依那西普在CD中的療效有限.相似的,人們正滿懷希望的探討抗IL-12和抗IL-6治療.IL-11是一種能增強(qiáng)腸上皮屏障功能且能抑制炎癥細(xì)胞因子分泌的白介素,但其作用仍在臨床評估中.抑制擁有CD和UC特征的破壞性免疫細(xì)胞的流入,為IBD的治療提供了另外的一個途徑因?yàn)榱馨图?xì)胞募集是一個高度調(diào)節(jié)的過程,所以潛在的可設(shè)計出有高度選擇性的抗炎治療方案.α4β7/MAdCAM-1和CCR9/CC25可作為小腸中CD的選擇性靶點(diǎn),而對于UC可能需要更多的途徑.Alicaforsen(ISIS2302)是一種能抑制ICAM-1反義核苷酸,已證明在公開標(biāo)簽的研究中對UC有效,α4β7的抑制物(MLN02Millennium)和CCR9的抑制物(Traficet-ENChemocentryx)對CD的作用也在評估中.這些藥物的應(yīng)用不僅有益于IBD患者,也有益于正罹患原發(fā)性硬化性膽管炎等腸外疾病的患者.6干預(yù)淋巴細(xì)胞歸巢腸道LH是多種黏附分子參與、多步驟的反應(yīng)過程,其對腸免疫屏障的平衡有重要意義,并且是IBD重要發(fā)病機(jī)制之一.因此通過干預(yù)淋巴細(xì)胞歸巢為該類疾病提供了新的治療途徑.相信隨著分子生物學(xué)和臨床藥理學(xué)研究的進(jìn)展,必將推進(jìn)這一重要領(lǐng)域的深入研究.2.1cdeb基因t、cd3和cd87細(xì)胞因子檢測主要包括選擇素家族的L-選擇素、整合素家族的α4β7和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原LFA-1(αLβ2)等.其與相對應(yīng)的地址素相互識別、相互作用可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附和游出過程.L-選擇素、α4β7和LFA-1的配體(地址素)分別為黏膜地址素細(xì)胞黏附分子-1(mucosaladdressincelladhesionmolecule-1,MAdCAM-1)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)/血管細(xì)胞黏附分子-1(vascularadhesionmolecule-l,VCAM-l),均屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulinsuperfamily,IgSF),具有與Ig相似的結(jié)構(gòu)特征.外周淋巴結(jié)地址素(peripherallymphnodeaddressin,PNAd)是一種特殊形式的MAdCAM-1,即為碳水化合物抗原決定簇修飾的MAdCAM-1.趨化性細(xì)胞因子是一個蛋白質(zhì)家族,分子質(zhì)量多為8-10kDa.與淋巴細(xì)胞歸巢相關(guān)的趨化性細(xì)胞因子很多[14,15,16,17,18,19],按半胱氨酸的位置、排列方式和位置可分為四個亞家族,其中最具代表性的是CCR9.CCR9和整合素α4β7聯(lián)合表達(dá)于歸巢至腸道的淋巴細(xì)胞,選擇性運(yùn)輸至小腸.通過活體顯微鏡檢查能直觀的觀察到在正常和TNF-α刺激條件下淋巴細(xì)胞依賴CCR9/CCL25黏附于鼠小腸內(nèi)皮.有研究表明IBD中炎癥浸潤部位的腸黏膜中T、B細(xì)胞總數(shù)量增加,各具體亞群有增有減.SAMP1/Yit小鼠能自發(fā)性發(fā)生回腸炎癥,是研究IBD的重要動物模型.Matsuzakietal用熒光標(biāo)記T細(xì)胞,再從尾靜脈注入受體小鼠,并用活體顯微鏡監(jiān)測派伊爾淋巴結(jié)(peyerpatches,PP)毛細(xì)血管后微靜脈、黏膜下層微血管和末端回腸絨毛毛細(xì)血管內(nèi)的T細(xì)胞歸巢,發(fā)現(xiàn)與AKR/J小鼠和15wk齡的SAMP1/Yit小鼠相比,35wk的SAMP1/Yit的小鼠HEV內(nèi)T淋巴細(xì)胞歸巢明顯增強(qiáng),免疫組化技術(shù)證實(shí)CD4、CD8和β7整合素陽性的細(xì)胞浸潤增加.與此相似,Teramotoetal把從脾臟提取的T和B淋巴細(xì)胞用熒光標(biāo)記后注入受體小鼠,再用右旋葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium,DSS)誘導(dǎo)結(jié)腸炎活體顯微鏡觀察提示受體結(jié)腸黏膜及黏膜下層內(nèi)T和B淋巴細(xì)胞的黏附均顯著增強(qiáng).諸多文獻(xiàn)認(rèn)為,LH增多是腸道淋巴細(xì)胞數(shù)目增加的重要機(jī)制之一.CD和UC中CD4+T細(xì)胞歸巢顯著增加,其中CD以分泌IFN-γ和IL-2的Th1型細(xì)胞為主,而UC以非典型的Th2型細(xì)胞占優(yōu)勢,其分泌TGF-β和IL-5而不分泌IL-4.IBD的發(fā)生發(fā)展與上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞含量也密切相關(guān).外周血及腸黏膜固有層以CD4+T細(xì)胞占優(yōu)勢,而上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intraepitheliallymphocytes,IELs)90%以上是CD3+的T細(xì)胞,其中主要是CD8+T細(xì)胞,而CD4+T細(xì)胞極少.腸黏膜固有層中一部分CD8+T淋巴細(xì)胞可遷移至絨毛頂部附近形成IELs.CD8+TIEL群包括CD8αα和CD8αβT細(xì)胞,可表達(dá)γδ或αβ受體.Nataschaetal報道CD患者腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞對上皮來源的靶細(xì)胞的細(xì)胞溶解活動明顯加強(qiáng),CD8+IEL較正常人明顯升高;CD患者T細(xì)胞表型和功能上的改變只限于腸黏膜的淋巴細(xì)胞,而血液中T細(xì)胞的功能沒有變化,IEL對腸組織的細(xì)胞溶解活動明顯加強(qiáng).IBD中LH顯著增強(qiáng),淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞表面歸巢相關(guān)分子表達(dá)也伴隨增加,其中最重要的是α4β7/MAdCAM-1分子.多種IBD動物模型中均能檢測到顯著增加的MAdCAM-1蛋白.近年來開發(fā)出一種可增強(qiáng)超聲成像的膠囊,其內(nèi)含有可與MAdCAM-1特異結(jié)合的微氣泡(microbubbles,MB).Bachmannetal給SAMP1/Yit結(jié)腸炎小鼠服用此種膠囊后作腹部超聲,發(fā)現(xiàn)MB可聚集于腸道炎癥部位,產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的回聲.CD和UC患者炎癥部位的腸黏膜中都含大量的MAdCAM-1陽性的的血管,并且在炎癥部位的潰瘍底部E-選擇素表達(dá)相似,但前者潰瘍底部MAdCAM-1陽性的的血管明顯比后者豐富.MAdCAM-1陽性的的血管在腸道深層表達(dá),主要在集合淋巴結(jié),是CD的特征之一.MAdCAM-1在CD中的廣泛表達(dá)可導(dǎo)致腸道透壁性炎癥.在UC急性期,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1也明顯增加,同時伴有其配體LFA-1表達(dá)增加,提示其在炎性細(xì)胞進(jìn)入病變組織過程中起重要作用.有研究表明嗜酸性粒細(xì)胞在結(jié)腸的聚集依賴于β2整合素/ICAM-1而不是α4β7,在ICAM-1-/-的小鼠,嗜酸性粒細(xì)胞性的結(jié)腸炎表現(xiàn)明顯緩解.另外,ICAM-1基因的多態(tài)性與IBD的發(fā)病密切相關(guān).CCL25/CCR9是生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)小腸LH的重要趨化因子,隨著CD炎癥進(jìn)展,CCL25和CCR9在調(diào)節(jié)小腸淋巴細(xì)胞歸巢中的顯著作用減弱.針對CCL25和CCR9的靶向治療只有在SAMP1/Yit小鼠模型疾病的早期有效,提示在疾病后期非特異的炎癥信號起主要作用.在CD的炎癥部位趨化因子Fractalkine(CX3CL1)表達(dá)增加,其兩種同質(zhì)異型配體之一的T280M能影響克羅恩病的臨床表現(xiàn)和發(fā)病部位.(dendriticcells,DC)與LH生理和炎癥狀態(tài)下的LH都與DC細(xì)胞密切相關(guān),DC和T細(xì)胞的相互作用參與IBD的發(fā)病過程.Drakesetal通過輸入CD45RBhiCD4+T細(xì)胞至重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立結(jié)腸炎模型,分離結(jié)腸的DC細(xì)胞與同系基因型、同種異體基因型脾臟CD4+T細(xì)胞和自體結(jié)腸分離T細(xì)胞的免疫反應(yīng),發(fā)現(xiàn)結(jié)腸DC與自體固有層的T細(xì)胞共同培養(yǎng)時所產(chǎn)生的IFN-γ和IL-6數(shù)量顯著高于與同系基因或同種異體基因型脾臟T細(xì)胞共同培養(yǎng)的含量.Hartetal用多色流式細(xì)胞計量術(shù)分析IBD患者黏膜固有層中DC細(xì)胞表面分子,并用胞內(nèi)染色分析DC在無外源性刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn)IBD時,DC細(xì)胞激活,表面微生物識別受體上調(diào)并產(chǎn)生更多的促炎細(xì)胞因子.與此相對應(yīng),Baumgartetal研究了活動性和非活動性IBD患者及其正常人類漿DC(PDC)和髓系DC(MDC),觀察到IBD急性期外周血中未成熟的DC細(xì)胞顯著減少,緩解期IBD患者PDC和MDC數(shù)量與正常對照組基本接近.雖然CD和UC的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)不全相同,但他們都有大量免疫細(xì)胞浸潤腸道.在IBD中促炎癥細(xì)胞因子的上調(diào)可導(dǎo)致血管黏附分子的表達(dá)增加,使炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤.與黏膜血管上的MAdCAM-1表達(dá)增加相對應(yīng),IBD患者中的炎癥細(xì)胞可通過腸道特異的方式歸巢至黏膜固有層.一旦炎癥已經(jīng)建立,引導(dǎo)器官特異歸巢到組織的信號的作用往往不及一般性的炎癥相關(guān)過程所起的作用.對腸道共棲菌的免疫失調(diào),過多的TLR配體和促炎細(xì)胞因子的持續(xù)過分泌能激活上皮和內(nèi)皮細(xì)胞,因此能促進(jìn)白細(xì)胞募集至腸黏膜間隙.激活的中性粒細(xì)胞能產(chǎn)生大量的超氧陰離子和活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),這些分子具有很高的反應(yīng)性,可以與細(xì)菌的細(xì)胞膜、核酸分子及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng),造成微生物的損傷和死亡.此外,ROS還可上調(diào)一些細(xì)胞因子及黏附分子如TNF-α、IL-1、ICAM-1的表達(dá)水平,放大炎癥效應(yīng).Yousefietal最近發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞一種全新的呼吸爆發(fā)機(jī)制.嗜酸性粒細(xì)胞生理?xiàng)l件下在嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的作用下在腸道黏膜固有層中維持較高基線水平.在IBD的炎癥部位內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)、C5a等可與IL-5發(fā)揮協(xié)同作用,觸發(fā)嗜酸性粒細(xì)胞瞬時彈射出線粒體DNA和陽離子蛋白,在胞外形成黏性網(wǎng)絡(luò)捕獲并在胞外殺滅細(xì)菌,同時造成自身組織損傷.N-乙酰葡糖胺-6-磺化酶對L-選擇素的配體活力是必須的,前者又被表達(dá)于高內(nèi)皮靜脈的N-乙酰葡萄糖胺-6-O-硫基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferase-1,GIcNAc6ST-1)催化,一旦缺乏,L-選擇素的配體嚴(yán)重受損.在UC的急性期能誘導(dǎo)HEV樣血管表達(dá)PNAd,這與編碼GIcNAc6ST-1的基因轉(zhuǎn)錄增加相關(guān),他能指導(dǎo)MECA-79表位的表達(dá),提示通過為循環(huán)中的T細(xì)胞提供額外的黏附位置,GIcNAc6ST-1在UC的發(fā)病中起一定的作用.亦有研究指出表達(dá)于HEV的唾液酸蛋白,當(dāng)其被一系列轉(zhuǎn)糖酶和轉(zhuǎn)磺酶作用后,才能夠作為L-選擇素的配體.報道的最多的是TNF-α細(xì)胞因子,Andoetal研究用TNF-α刺激一種新的結(jié)腸上皮細(xì)胞株MJC-1,發(fā)現(xiàn)24h內(nèi)MAdCAM-1的表達(dá)量明顯增加,并與TNF-α呈劑量依賴性同時淋巴細(xì)胞的黏附增加了2-6倍,其可運(yùn)用MAdCAM-1抗體來抑制.誘導(dǎo)MAdCAM-1表達(dá)增加的信號通路包括:蛋白激酶C、酪氨酸