茵陳蒿湯對dmn模型大鼠血清cdeccl4表達(dá)的影響

“辨證論治”是中醫(yī)學(xué)的核心內(nèi)容和靈魂。辨證論治在臨床診療中分為辨證、立法、選方、遣藥四個環(huán)節(jié),“證、法、方、藥”有機(jī)統(tǒng)一,即據(jù)證立法,依法選方或遣藥組方。“方證相應(yīng)”是指一個方劑內(nèi)的藥味及其配伍關(guān)系與其針對的病證病機(jī)或病理環(huán)節(jié)之間具有高度相關(guān)性或反應(yīng)性。“方證相應(yīng)”強(qiáng)調(diào)了方藥與其作用對象病證之間的相互作用,即方劑的功用是特定方藥與其作用對象特定病證之間相互作用的結(jié)果。那么方劑在改善患病個體自身感受及整體病理反應(yīng)狀態(tài)的同時,對疾病(證)的特征性病理變化的影響如何?“方-效-證”相結(jié)合的疑難疾病的基礎(chǔ)研究,能將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)的辨證論治精華更好地結(jié)合起來,可能為中醫(yī)現(xiàn)代化發(fā)展探索一條可行之路。肝硬化是多種慢性肝臟疾病的終末階段,以彌漫性肝纖維化伴異常結(jié)節(jié)形成為其形態(tài)學(xué)特征,嚴(yán)重影響人類健康。目前尚無有效的抗肝纖維化的化學(xué)或生物藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用。近年來,中醫(yī)藥整體觀念(系統(tǒng)論方法)指導(dǎo)下的病證結(jié)合、辨證論治治療模式對解決這一難題逐漸彰顯出理論特色和臨床優(yōu)勢,不但能改善臨床癥狀及肝功能,顯著提高患者的生活質(zhì)量,而且在抑制肝臟炎癥反應(yīng)及纖維組織增生,促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)等方面顯示出優(yōu)勢,已經(jīng)成為國內(nèi)肝病研究領(lǐng)域的熱點之一。體內(nèi)、外實驗研究表明,中藥復(fù)方具有多途徑(包括對纖維增生刺激因子、膠原及白蛋白基因表達(dá)等的影響),多靶點的綜合作用。但由于以往研究缺乏建立在科學(xué)實驗基礎(chǔ)上的病-證相關(guān)性研究和針對肝硬化中醫(yī)證候病機(jī)的基本治法、方劑的系統(tǒng)對照比較研究,中醫(yī)學(xué)辨證論治的優(yōu)勢并未得到充分的展示。如何進(jìn)一步發(fā)揮中醫(yī)學(xué)的思維優(yōu)勢,針對肝硬化中醫(yī)基本證候病機(jī)進(jìn)行代表方劑系統(tǒng)比較的實驗研究,探討疾病(肝硬化)、中醫(yī)證候病機(jī)及顯效方劑之間的相關(guān)性(“方-效-證”相關(guān)性),不僅在提高臨床療效方面具有重要的實際價值,對促進(jìn)中醫(yī)理論的創(chuàng)新與發(fā)展同樣具有重要的科學(xué)意義。本研究制備四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型,各模型動物采用具有清熱利濕作用的茵陳蒿湯(《傷寒論》:茵陳、梔子、大黃)干預(yù)治療,并采用國際慣用的小柴胡湯(《傷寒論》)作為對照,通過觀察動物的整體狀況、肝功能、病理組織學(xué)、肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,綜合判斷茵陳蒿湯的干預(yù)治療效果,對茵陳蒿湯對不同模型的藥效學(xué)進(jìn)行橫向比較,明確茵陳蒿湯對不同造模因子所致的同一疾病不同動物模型(證候)的療效特點及對凋亡通路的影響。1材料和方法1.1血清指標(biāo)測定CCl4,分析純,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號為20021219;橄欖油,購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號為20020819;DMN,購自日本東京化成株式會社(批號:MAL05)。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotransferase,ALT)測定試劑盒,批號為20031011;血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotransferase,AST)測定試劑盒,批號為20031021;血清白蛋白(albumin,ALB)測定試劑盒,批號為20031101;血清總膽紅素(totalbilirubin,TBil)測定試劑盒,批號為20031001,均購自衛(wèi)生部上海生物制品研究所。血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)檢測試劑盒,購自南京建成生物工程研究所,批號為20021103。對二甲基氨基苯甲醛(P-dimethylaminobenzal),購自上海三愛思試劑有限公司,批號為20031224。氯氨-T(chloramines-T),購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司,批號為20030510。Hyp標(biāo)準(zhǔn)品,購自日本Nakatitesuku株式會社,批號為MIR8282。TRIzol、雜交試劑盒、體外轉(zhuǎn)錄的標(biāo)記試劑盒、單循環(huán)cDNA合成試劑盒、生物素化抗體、鏈霉素和藻紅蛋白等試劑及基因芯片掃描儀3000、基因芯片洗滌工作站(AffymetrixFluidicsStation450)、Affymetrix基因芯片雜交爐640、GeneChip·操作軟件1.2等儀器、軟件均由上海生物芯片公司提供。1.2制備1.2.1成汁、、浸膏、藥汁茵陳蒿湯方出《傷寒論》,由茵陳蒿(ArtemisiacapillarisThunb.,山西)18g、梔子(GardeniajasminoidesEllis,浙江)10g、大黃(掌葉大黃,RheumpalmatumL.,產(chǎn)于青海同仁)6g組成。將梔子(1kg)與大黃(0.6kg)制成粗粉末,與茵陳蒿(1.8kg)一起水煎兩次,藥汁濃縮成浸膏,真空干燥后冷藏保存。生藥總重量為3.4kg,真空干燥后重量為0.565kg,每克含生藥6.018g。1.2.2藥品的生產(chǎn)及用量小柴胡湯方出《傷寒論》,使用日本Tsumura株式會社生產(chǎn)的顆粒劑(TJ-9顆粒劑,成人每日用量7.5g),每克含生藥5.45g,批號為20054732,為對照藥物。1.3實驗方法1.3.1實驗動物中心雄性Wistar大鼠140只,體質(zhì)量160~200g,購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心,許可證號為SCXK(滬)2003-0003。在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)、造模和觀察,大鼠自由攝食。1.3.1.小柴胡湯、艾陳蒿湯分組參照文獻(xiàn)方法。生理鹽水稀釋DMN為0.5%(v/v)濃度,以2mL/kg大鼠體質(zhì)量劑量,每日1次腹腔注射,每周連續(xù)3d,共4周;造模4周后隨機(jī)處死模型大鼠及同期正常對照大鼠各5只(干預(yù)用藥前對照),將其余模型大鼠隨機(jī)分為模型組(22只),茵陳蒿湯組(12只)和小柴胡湯組(15只),并開始用藥治療。經(jīng)口給藥(按照65kg體質(zhì)量成人臨床等效劑量的8倍)2周,茵陳蒿湯0.695g/kg(相當(dāng)于生藥4.185g/kg),小柴胡湯顆粒劑0.923g/kg(相當(dāng)于生藥5.03g/kg),大鼠按照10mL/kg體質(zhì)量來灌胃給藥,用藥干預(yù)至6周末;正常和模型對照組給予等體積的蒸餾水,用藥干預(yù)至6周末。1.3.1.各組大鼠的給藥及對ccl4染毒的影響參照文獻(xiàn)方法。50%CCl4-橄欖油溶液,2mL/kg大鼠體質(zhì)量皮下注射,每周2次,共12周。造模8周后隨機(jī)處死模型大鼠及同期正常對照大鼠各6只(干預(yù)用藥前對照),將其余模型大鼠隨機(jī)分為模型組(10只),茵陳蒿湯組(10只)和小柴胡湯組(10只),并開始用藥治療(給藥劑量同上)4周,正常和模型對照組給予等體積的蒸餾水,同時繼續(xù)予以CCl4染毒直至12周末。1.3.2樣品采集和處理1.3.3觀察指標(biāo)1.3.3.膠原纖維束放散和活性測定肝組織病理:蘇木精和伊紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察并作圖像分析。肝組織膠原纖維增生程度分期評分標(biāo)準(zhǔn):0期,正常肝臟,無明顯膠原纖維增生;Ⅰ期,膠原纖維增生,中央靜脈和門脈區(qū)有少量星芒狀膠原纖維束放散,但無間隔形成;Ⅱ期,膠原纖維增生,中央靜脈和門脈區(qū)結(jié)締組織變厚,由此向四周伸出纖維索,形成不完全間隔;Ⅲ期,膠原纖維大量增生,有個別菲薄的完全間隔形成;Ⅳ期,粗大的完全纖維間隔及大量假小葉形成。采用試劑盒檢測肝功能。血清總蛋白、白蛋白含量,溴甲酚綠法;血清TBil含量,重氮法;血清ALT、AST活性,賴氏法;GGT活性,按照南京建成生物制品研究所試劑盒說明書測定。肝組織Hyp(膠原蛋白)含量采用Jamall法。1.3.3.測量方法與數(shù)據(jù)處理提取各組肝臟總RNA,純化,合成cDNA,純化,生物素標(biāo)記cRNA,片斷化cRNA,雜交,洗脫、染色、掃描芯片?；蛐酒?AfymetrixRat2302.0基因表達(dá)譜芯片,共載基因探針31099個。RNA的抽提采用TRIzol試劑盒。用純化的RNA合成雙鏈cDNA,生物素標(biāo)記的cRNA的合成參考BioArrayTMHighYieldTMRNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒方法。將cRNA片段雜交于AfymetrixRat2302.0芯片?；蛐酒臄?shù)據(jù)處理:首先將信號進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和基于模型的表達(dá)指數(shù)(model-basedexpressionindex,MBEI)分析,得出校正后的數(shù)值,用于差異基因分析。特征性基因表達(dá)譜分析采用聚類分析法。特征性基因的篩選采用Foldchange法,兩個芯片的每個基因之間倍數(shù)通過表達(dá)指數(shù)比值得出,以識別特征性基因,并用MBEI的標(biāo)準(zhǔn)誤差來計算倍數(shù)的可信區(qū)間,本研究在組間進(jìn)行比較時,以倍數(shù)的可信下限(1owerbound)作為基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的評判標(biāo)準(zhǔn)。1.4計學(xué)分析采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料數(shù)據(jù)以表示,采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,組間兩兩比較采用q檢驗,等級資料采用Ridit分析。2結(jié)果2.1不同造模時間對大鼠肝組織hyp的影響在DMN模型中,藥物干預(yù)治療前模型組大鼠死亡1只;與正常大鼠比較,隨著造模時間的延長,模型大鼠血清ALTAST、GGT活性和TBil含量逐漸升高,均于4周時達(dá)到高峰(P<0.01);血清Alb含量逐漸降低,4周時降至最低(P<0.01);與6周模型對照組比較,茵陳蒿湯組大鼠血清ALT、AST和GGT活性及TBil含量顯著降低(P<0.05或P<0.01),血清ALB含量顯著升高(P<0.05)。CCl4模型中,藥物干預(yù)治療前模型組大鼠死亡5只,干預(yù)治療后小柴胡湯組死亡2只;與正常大鼠比較,隨著造模時間的延長,大鼠血清ALT、AST、GGT活性和TBil含量逐漸升高,均于12周時達(dá)到高峰(P<0.01);與此相反,模型大鼠血清Alb含量逐漸降低,12周時降至最低(P<0.01)。與12周模型組比較,茵陳蒿湯顯著降低ALT、AST和GGT活性(P<0.05),但對TBil和ALB含量的改善作用不明顯。見表1。正常大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列,其間有不規(guī)則的肝竇,中央靜脈及匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常(圖1A)。DMN染毒4周末,肝內(nèi)仍有較大面積的出血性病變,可見典型的橋狀壞死,殘存肝細(xì)胞明顯腫脹,胞漿疏松,匯管區(qū)明顯增寬,纖維間隔粗大、致密,形成大量大小不等的假小葉(圖1C)。6周時模型大鼠肝內(nèi)仍有散在出血,炎癥細(xì)胞浸潤減少,肝細(xì)胞腫脹減輕,肝細(xì)胞索排列仍較紊亂,纖維間隔較4周時變細(xì),但仍有完全間隔存在(圖1D)。與6周模型大鼠比較,茵陳蒿湯組肝細(xì)胞形態(tài)接近正常大鼠,肝細(xì)胞變性、壞死極少,可見較多的肝細(xì)胞增生、分裂現(xiàn)象,肝細(xì)胞索排列較為有序,肝竇較清晰,竇壁細(xì)胞增生仍較明顯;纖維結(jié)締組織疏松、纖細(xì)、不連續(xù),纖維束內(nèi)的成纖維細(xì)胞減少(圖1)。CCl4染毒12周后,正常肝小葉結(jié)構(gòu)完全被破壞,大量的纖維結(jié)締組織增生,形成大小不一的典型的假小葉結(jié)構(gòu),假小葉內(nèi)以脂肪變的肝細(xì)胞為主(圖2D);間隔內(nèi)可見大量的成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤,膽管損害嚴(yán)重,極少能見到正常的膽管樣結(jié)構(gòu),有大量小膽管增生(圖2D)。與12周模型對照組比較,茵陳蒿湯組、小柴胡湯組肝組織病理無明顯改善(圖2)。肝纖維化程度分布見表2。DMN誘導(dǎo)大鼠肝硬化后,隨著造模時間延長,模型大鼠肝組織Hyp含量逐漸升高,4周時達(dá)到高峰;停止造模后,模型組大鼠肝組織Hyp含量略有下降。與6周模型組比較,茵陳蒿湯大鼠肝組織Hyp含量顯著降低(45.57%)(P<0.01,見表2)。在CCl4模型中,與正常大鼠比較,4、8和12周時模型大鼠肝組織Hyp含量隨造模時間延長顯著升高(P<0.01)。與12周模型對照組比較,茵陳蒿湯組、小柴胡湯組Hyp含量有降低趨勢,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表2)。2.2ccl4模型大鼠caspase-12表達(dá)全基因組基因芯片顯示,DMN和CCl4誘導(dǎo)的肝硬化(動態(tài))模型基因的改變是不同的,而茵陳蒿湯對兩個模型的基因調(diào)控也有顯著差異(圖3~10)。DMN造模2周后,模型組大鼠肝組織干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferonregulatoryfactor-1,IRF-1)、Fas與Bax基因表達(dá)即顯著上調(diào),分別為正常組的2.24倍、2.89倍和1.9倍,4周時IRF-1略有下降,而Fas與Bax基因表達(dá)繼續(xù)升高至正常組的3.42倍和2.68倍,停止造模后,IRF-1與Bax基因迅速下調(diào),而Fas基因仍較正常組高2.04倍,茵陳蒿湯顯著抑制Fax、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表達(dá),促進(jìn)Bcl-xl和肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)。在CCl4模型中,隨著造模時間的延長,肝細(xì)胞凋亡指數(shù)逐漸增加,且不同時間點(4、8和12周)模型之間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)略);基因芯片結(jié)果顯示,caspase-12在正常組不表達(dá),造模4周時可檢測到表達(dá),隨著肝纖維化的加重表達(dá)逐漸升高,12周時分別為4周和8周的1.54倍和2.31倍;在肝硬化形成過程中,caspase-3、caspase-8表達(dá)也有不同程度的上調(diào);凋亡通路分析顯示,凋亡受體通路的Fas和線粒體凋亡通路的活化因子Myc基因表達(dá)持續(xù)顯著上調(diào),且12周時核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)基因表達(dá)亦顯著上調(diào)?？沟蛲鲆蜃覤cl-2基因在正常組表達(dá),而造模12周時不表達(dá),同時肝臟蛋白質(zhì)組差異表達(dá)研究顯示CCl4造模12周后模型大鼠有caspase-12蛋白表達(dá)。茵陳蒿湯未能抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,雖然也抑制caspase-12的表達(dá),但與模型組比較無明顯差異,也未能明顯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞凋亡通路。3不同模型的凋亡及對ccl4大鼠對細(xì)胞凋亡的活性判斷研究發(fā)現(xiàn),盡管茵陳蒿湯對DMN(4周造模)和CCl4(12周造模)兩種大鼠肝硬化模型都表現(xiàn)出了療效,但卻不盡相同,對DMN模型的干預(yù)尤其是降低肝組織羥脯氨酸含量、改善肝組織病理變化的作用顯著優(yōu)于CCl4模型。全基因組基因芯片顯示,DMN和CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型基因的改變是不同而且是差異巨大的,茵陳蒿湯對兩個模型的基因調(diào)控也有顯著差異。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,茵陳蒿湯對DMN和CCl4肝硬化模型的過氧化損傷、肝細(xì)胞凋亡和膠原代謝等均呈現(xiàn)了不同的干預(yù)作用。肝細(xì)胞凋亡是肝臟損傷的基本要素之一,也是多種慢性肝病的共同病理特征。在DMN誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷中,大劑量單次注射DMN3h后電子顯微鏡下即發(fā)現(xiàn)小葉中央?yún)^(qū)出現(xiàn)凋亡肝細(xì)胞。已有研究表明在CCl4大鼠肝纖維化模型中也有大量的肝細(xì)胞凋亡。我們的研究顯示CCl4和DMN誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化進(jìn)展期均存在大量的肝細(xì)胞凋亡。正常大鼠肝細(xì)胞的凋亡率很低,DMN染毒后模型大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高,于造模2周時達(dá)到高峰,此后逐漸減少,但仍顯著高于正常組,表明肝細(xì)胞的病理性凋亡是DMN大鼠肝硬化形成過程中一個突出的病理現(xiàn)象。促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因均在模型進(jìn)展期逐漸高表達(dá),提示肝細(xì)胞凋亡在DMN和CCl4大鼠肝硬化形成中發(fā)揮重要作用。研究表明茵陳蒿湯不僅可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞株McA-RH8994凋亡,也可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,而在TGF-β1處理7h后,茵陳炔酮和茵陳炔烯(茵陳蒿湯主要成分)仍表現(xiàn)出相同程度的抑制細(xì)胞凋亡的活性,表明它們不是阻礙TGF-β1與受體的結(jié)合,而可能是作用于細(xì)胞死亡的過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)預(yù)先以都桷子素處理可以抑制Jo2誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織中caspase-3、8的活化,增強(qiáng)肝線粒體對Ca2+誘導(dǎo)的MPT(線粒體滲透性轉(zhuǎn)變)的抵抗。我們的研究結(jié)果揭示茵陳蒿湯對兩個模型的細(xì)胞凋亡顯示了不同的甚至截然相反的作用。在DMN大鼠肝硬化模型中,茵陳蒿湯組大鼠的肝細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著低于4周模型組?；蛐酒蚖esternblotting(數(shù)據(jù)略)實驗結(jié)果表明,茵陳蒿湯顯著抑制Fas、Bax、caspase-3的表達(dá),促進(jìn)Bcl-xl和肝細(xì)胞生長因子的表達(dá)。在CCl4模型中,茵陳蒿湯沒有顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡,雖然也抑制caspase-12的表達(dá),但與模型組沒有顯著差異,沒有明顯抑制ER細(xì)胞凋亡通路,反而促使酪氨酸激酶受體(在腫瘤血管形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用)上調(diào)了4.8倍。為什么茵陳蒿湯對不同的造模因子制備的同一疾病的經(jīng)典模型的治療作用是截然不同的呢?同一方劑對這兩個肝硬化模型卻產(chǎn)生不同療效的病理基礎(chǔ)是什么呢?DMN和CCl4肝硬化模型肝細(xì)胞凋