實(shí)驗(yàn)七：SOD的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)七：SOD的含量測(cè)定一、超氧化物歧化酶的基本特性

及生理功能1、超氧化物歧化酶的組成超氧化物歧化酶是一種能催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)的金屬酶，按金屬輔基不同分為三類(lèi)：

Cu,Zn-SODMn-SODFe-SOD一、超氧化物歧化酶的基本特性

及生理功能1、超氧化物歧化酶的2、超氧化物歧化酶的生理功能（1）延緩由于自由基侵害引起的衰老現(xiàn)象（2）治療由自由基損傷而誘發(fā)的疾?。?）消除肌肉疲勞（4）提高人體的抵抗力2、超氧化物歧化酶的生理功能蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法定氮法紫外分光光度法雙縮尿法（Biuret法）

Folin－酚試劑法（Lowry法）

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈10～20倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測(cè)定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無(wú)缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法定氮法在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮的幾點(diǎn)因素①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮的幾點(diǎn)因素①實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精一、紫外分光光度法

蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。

一、紫外分光光度法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸二、雙縮脲法（Biuret法）

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類(lèi)化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。二、雙縮脲法（Biuret法）雙縮脲（NH3C三、Folin—酚試劑法（Lowry法）

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。

進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20-250mg。三、Folin—酚試劑法（Lowry法）此法的四、考馬斯亮蘭法（Bradford法）1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法。

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

四、考馬斯亮蘭法（Bradford法）197SOD含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。掌握考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。SOD含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理

本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定SOD濃度?？捡R斯亮藍(lán)G-250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍(lán)色，它和蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力（Vanderwals′bond）結(jié)合，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律（Beer′slaw）。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色由紅色形式轉(zhuǎn)變成藍(lán)色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過(guò)測(cè)定595nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。280nm275nm實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定SOD濃度?？捡R儀器：電子天平、紫外分光光度計(jì)、小燒杯、容量瓶、玻璃比色皿、洗瓶、試管、濾紙、擦鏡紙、移液管試劑：超氧化物岐化酶、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、

95％乙醇、NaCl考馬斯亮藍(lán)試劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)G-250100mg溶于50ml95％乙醇，加入100ml85％磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01％（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7％（W/V）乙醇，8.5％（W/V）磷酸。儀器與試劑儀器：電子天平、紫外分光光度計(jì)、小燒杯、容量瓶、儀器1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱(chēng)取SOD10mg，用0.15mol/mlNaCl配制成1mg/ml蛋白溶液。取7支試管，按下表操作。試管編號(hào)01234561mg/mlSOD溶液/ml00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl/ml0.100.090.080.070.060.050.04考馬斯亮蘭試劑/ml5ml搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱(chēng)取SOD102.樣品測(cè)定：

精密吸取1mg/ml的SOD溶液0.035ml，再加入0.065ml的0.15mol/LNaCl溶液，混勻后，加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，搖勻，1h內(nèi)以0號(hào)試管為空白