動物實驗基本知識

和操作技術上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心湯家銘進行動物實驗操作前必須注意的事一、動物福利和動物實驗倫理問題什么是動物福利？動物福利是指動物在整個生命過程中應得到人類的保護，其基本原則是要善待動物，保證動物的健康和快樂。動物福利的提出是基于這樣一個觀點，即動物與人一樣，有思維、有情感，應當給予與人一樣的生存權。臺灣學者夏良宙（1990年）把動物福利概括成兩句話：

善待活著的動物，減少動物死亡的痛苦。

應該再加一句：動物死后應得到妥善處理。在國際上被普遍認可的動物福利包括以下5個內(nèi)容，即：應提供給動物滿足生長發(fā)育和繁衍后代的營養(yǎng)食物和清潔的飲水，使其免受饑渴。（吃好喝好）應提供給動物適當?shù)臈⒅睾惋曫B(yǎng)場所，使其能休息和睡眠。（休息好）應提供預防動物疾病和患病后及時診療的措施，使其免受疾病和傷害的痛苦。（健康成長）應提供給動物安靜的飼養(yǎng)環(huán)境，無刺激動物發(fā)生應激和恐懼的場面和聲音。（平靜生活）應提供給動物同類一起自由玩耍、表達天性的空間和自由。（表達天性）飼養(yǎng)繁殖實驗動物的目的是用實驗動物作為人類的替難者進行各種生物醫(yī)學研究。一方面隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，實驗動物的使用量逐年增加，使用種類也逐年擴大；另一方面從動物福利和動物實驗倫理學考慮，又需要盡量減少一些不必要的動物實驗，特別是人類的寵物諸如貓、犬、猴等，或者在不得不做的動物實驗中盡可能將動物的痛苦、壓迫和不適降到最低。動物實驗的倫理判斷標準：1.必須權衡實驗的目和得出的結(jié)論與動物由此而受到的傷害和死亡。2.必須清楚而且明確「沒有任何替代方法可達到所做的動物實驗的目的」這個前提。3.必須將動物的痛苦、壓迫和不適減到最低程度。二、

動物實驗是實踐性非常強的技術和方法，不能僅靠書本理論知識，需要通過反復實踐加以掌握。目的：保證實驗的順利進行。減少動物承受的痛苦。成為熟練掌握動物實驗操作技術的能手或?qū)＜覒撌谴髮W/研究所每一個動物飼養(yǎng)管理人員所追求的目標。動物實驗前的準備1.所用動物實驗設施是否符合本實驗要求

普通設施，清潔級、SPF設施，感染性設施，有毒有害供試品設施，放射性設施實驗室、手術室2.所用實驗動物的品種、品系、性別、數(shù)量等能否得到所需要的動物實驗技術是否熟練掌握所用動物實驗器具、試劑是否準備好所用的儀器設備是否處于可運行狀態(tài)6.預實驗正式實驗前的演習預實驗可用少量動物進行預實驗結(jié)果不能并入正式實驗結(jié)果一起分析。一、動物的抓取動物的抓取是順利進行各項動物實驗操作最基本的一個環(huán)節(jié)。應熟練掌握各種實驗動物的抓取方法，用輕柔的手法把對動物施加的恐懼和痛苦降到最低。一般說來動物是不會主動攻擊人的。小鼠抓取的注意點大鼠抓取的注意點3.豚鼠抓取的注意點4.兔抓取的注意點最好戴人造革圍裙和袖套，以免爪子抓傷。采用正確地抓取方法?？刹捎猛霉潭ㄆ鞴潭ㄟM行實驗操作，或一人抓取固定，一人實驗操作。豚鼠和兔的抓取5.犬抓取注意點實驗用犬有專用的比格犬和農(nóng)村收購來的草犬。犬是通人性的，草犬購入后，飼養(yǎng)人員和實驗人員要經(jīng)常親近它們，使它放松對你的警惕，容易直接抓取它們。不要輕易使用長柄鐵鉗，鉗傷造成的傷害會使它對你更加恐懼，影響以后實驗的進行。抓取后用繩子將嘴綁住。二、動物實驗分組設計（一）一般動物試驗分組設計的基本原則：隨機、對照和重復。隨機：就是按照機遇均等的原則來進行分組。其目的是盡量減少各種干擾因素造成的實驗誤差，不受實驗者主觀因素或其他偏性誤差的影響。隨機化的手段可采用編號卡片抽簽法，隨機數(shù)字表或采用計算器的隨機數(shù)字鍵。

對照：是要求在實驗中設立可與實驗組比較，用以消除各種無關因素影響的對照組。對照應有可比性：同時同地同條件對照設立有兩種方式：自體對照1.實驗前后對照2.身體左右對照組間對照（以手術造成兔腹主動脈損傷動脈粥樣硬化模型為例）1.正常（空白）對照組：正常飲食，不做手術2.假手術組：正常飲食，做手術3.模型組：手術+高脂飼料4.已知療效藥物組：手術+高脂飼料+已知療效藥物5.未知療效藥物組：手術+高脂飼料+未知療效藥物6.賦型劑對照：手術+高脂飼料+賦型劑重復：是指同一處理要設置多個樣本數(shù)。重復的主要作用是估計試驗誤差、降低試驗誤差和增強代表性，提高實驗結(jié)果的精確度，保證實驗結(jié)果能在不同個體中穩(wěn)定地重復出來。樣本數(shù)過少，實驗處理效應不能充分顯示；樣本數(shù)過多，又會增加實際工作中的困難。因此在進行實驗前必須確定最少的樣本例數(shù)。最少的樣本例數(shù)可按一般估測方法確定，也可通過統(tǒng)計學方法進行測算確定。（二）動物實驗分組設計的基本類型1.完全隨機化設計2.按體重分層隨機區(qū)組設計3.配對設計（二）按體重分層隨機區(qū)組設計

先確定實驗的組數(shù)，將動物稱重，按體重的輕重順序編號，再用隨機化工具，如隨機數(shù)字表等，將動物隨機分配至處理組及對照組。隨機區(qū)組法舉例以用四氧嘧啶誘發(fā)小鼠糖尿病模型，用藥物進行治療觀察療效為例，實驗中可分為5組：正常對照組、模型組、藥物治療低劑量組、高劑量組和已知可治療糖尿病藥物組，每組10只，5雌5雄。按下列步驟進行分組：1）雌雄分開：分組時雌、雄動物分開分別進行。2）用記號筆在小鼠尾巴上隨機編1-25號。3）按編號稱重，記錄每只小鼠的體重。4）按動物體重順序依次重新編號。5）共5個實驗組分成5個區(qū)組，每個區(qū)組都有5只體重相近的動物。第一區(qū)組5只動物為1、2、3、4、5號，第二區(qū)組為6、7、8、9、10號，余類推。6）抄錄隨機數(shù)表。抄錄數(shù)字的個數(shù)等于區(qū)組數(shù)減1，如5個區(qū)組就抄錄4個數(shù)字。第5個動物無隨機數(shù)字，其分組為調(diào)劑。以后的區(qū)組按順序依次抄錄數(shù)字。7）將小鼠分到各組中。動物編號123456789101112131415隨機數(shù)字052784374168385156968180除數(shù)555555555555余數(shù)024213311110組別524311342512354動物編號16171819202122232425隨機數(shù)字4788745972402363除數(shù)55555555余數(shù)23442033組別2345125341按體重分層隨機區(qū)組分組三、動物編號常用的標記方法適用需要個體識別的實驗染料標記法：適合白色被毛的動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等。黃色：常用3~5%苦味酸溶液紅色：常用0.5%中性紅溶液咖啡色:2%硝酸銀溶液黑色：煤焦油酒精溶液優(yōu)點：簡單、易識別缺點：長期易退色；不能編大號碼。2.剪耳（打孔）法：嚙齒類小動物3.號碼鉗法：適用于兔、犬等大動物4.耳牌法：適用于羊、牛等大家畜5.電子芯片植入法：四、動物被毛的去除方法1.剪毛法：用彎頭剪逆毛方向剪適用于各種實驗動物2.拔毛法：常用于兔的耳緣靜脈注射3.剃毛法：剃須刀、手術刀適用于大動物4.脫毛法：脫毛劑常用脫毛劑配方配方1：硫化鈉8g溶于100mL水中。配方2：硫化鈉：肥皂粉：淀粉的比例為3：1：7，再加水調(diào)成糊狀。配方3：硫化鈉10g和生石灰15g溶于100mL水中。配方1和2適用于家兔和嚙齒類動物的脫毛，配方3適合給犬脫毛。脫毛后用清水將脫毛區(qū)清洗干凈。五、實驗動物的麻醉方法

對實驗動物進行麻醉的目的是，消除實驗過程中引起的痛苦和不適，確保實驗動物的安全和動物實驗的順利進行，是動物實驗倫理的一個重要方面。麻醉方法有全身麻醉和局部麻醉兩種。在實驗動物的麻醉中絕大多數(shù)采用全身麻醉。應結(jié)合實驗目的、實驗動物種類、日齡及健康狀況等因素進行綜合考慮，決定選用的麻醉劑和麻醉方法。全身麻醉簡稱全麻。全麻是指麻醉藥通過呼吸道吸入、靜脈和肌肉注射等途徑，進入實驗動物體內(nèi)，使其產(chǎn)生短時間意識喪失、痛覺消失、肌肉松弛和反射抑制等中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制現(xiàn)象。當麻醉藥從體內(nèi)排出或在體內(nèi)代謝破壞后，實驗動物逐漸清醒，不留后遺癥。全麻有吸入麻醉法和注射麻醉法兩種途徑，吸入麻醉法用揮發(fā)性麻醉藥，注射麻醉法用非揮發(fā)性麻醉藥。（1）吸入麻醉法常用藥物為乙醚、氟烷和異氟烷等。吸入麻醉法有開放吸入和氣管內(nèi)插管吸入兩種方法。開放吸入：適用于嚙齒類小動物，可用乙醚、氯仿小動物吸入麻醉機國外已有售。氣管內(nèi)插管：適用于犬、猴、羊等大動物，氟烷和異氟烷是最常用的麻醉藥。吸入麻醉的優(yōu)點：麻醉平穩(wěn)、安全可靠、停止吸入后很快蘇醒缺點：需要一定的儀器設備，

注意自身防護。大小鼠麻醉法（2）注射麻醉法注射麻醉法是使用非揮發(fā)性麻醉藥進行全麻的方法。在動物實驗中比較常用。常用麻醉藥：戊巴比妥鈉硫噴妥鈉氯氨酮烏拉坦大動物：靜脈注射或肌肉注射嚙齒類動物：腹腔注射實驗動物麻醉應注意的事項大動物麻醉之前應禁食。麻醉之前應準確稱量動物體重，作為計算麻醉劑用量的依據(jù)。應注意不同麻醉藥對動物的作用是不同的，如戊巴比妥鈉、硫賁妥鈉等能抑制心肌收縮力，使肌肉松弛，而氯胺酮則相反。大動物犬、猴、羊等麻醉前半小時應注射麻醉前給藥如阿托品和苯巴比妥鈉。靜脈注射麻醉藥是必須緩慢，邊注射邊觀察動物的意識、角膜反射、肌肉緊張性和對疼痛的反應，達到麻醉要求時應停止注射。6.大動物手術時應配備麻醉師，在麻醉過程中密切觀察動物的反應，如血壓、脈搏、呼吸和體溫，及時調(diào)節(jié)麻醉藥劑量，保證手術順利進行。7.動物在麻醉期間、手術后至蘇醒期體溫會下降，應注意手術室的室溫。8.注意術后護理。麻醉意外的搶救原因：麻醉藥速度過快、劑量過大、麻醉過深后果：中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制導致呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)功能障礙，引起呼吸、心跳停止。搶救方法：要針對具體情況，采取對癥治療的措施。

1.立即停止供給麻醉劑

2.人工呼吸，吸氧

3.蘇醒劑

4.呼吸中樞興奮劑如可拉明等和心臟和呼吸興奮劑，如0.1%腎上腺素適量作心內(nèi)或靜脈注射，靜脈滴注50%葡萄糖溶液等。六、實驗動物的給藥方法經(jīng)口給藥法注射法其它途徑給藥方法呼吸道給藥皮膚給藥脊髓腔內(nèi)給藥腦內(nèi)給藥直腸內(nèi)給藥關節(jié)腔內(nèi)給藥經(jīng)口給藥拌入飼料、飲水中自由攝取優(yōu)點：省人力缺點：因個體差異，攝入量不等灌胃優(yōu)點：能準確定量缺點：給動物造成一定的痛苦，需熟練掌握技術大小鼠灌胃注意點用灌胃針。從嘴角處插入，到達咽部后改變灌胃針的方向，使其與食管的走向一致，然后順利插入。成年大鼠由于體型較大，不易保定。辦法：1）一人保定，一人灌胃2）操作者抓取后，將大鼠尾部按在自己的胸部，達到固定尾部的目的，然后灌胃。灌胃量：小鼠0.2-0.4ml/10克，大鼠1.0ml/100克大小鼠灌胃

兔灌胃法采用用固定器一人操作，或一人保定一人操作法。操作者用左手拇指和中指擠壓家兔兩頰，將下頜擠開使兔被動張口，右手將開口器從一側(cè)口角插入口腔并固定，用泡在水中的14號細導尿管，經(jīng)開口器的孔插入，向前推進約15cm，可達胃內(nèi)，確認泡在水中的導管另一端沒有冒氣泡，說明沒有誤入氣管，即可注入藥液。灌胃量為每只每次80-150mL。兔灌胃法1.口服給藥用右手將口服藥片夾在拇指和食指之間，把左手放在犬的圈套上，用拇指和食指壓著犬的上唇，用力使犬的頭向后仰，繼而把右手中指放在犬的下頜向下壓。當犬的嘴張大時，快速把藥片放在舌根隆起的部位，合上犬的嘴，維持頭后仰姿勢，右手在咽喉部輕輕按摩。借助犬本能的吞咽動作服下藥片。犬的膠囊給藥法2.灌胃給藥在給犬灌胃時，將犬固定于特制的固定架上，實驗時將木制開口器從一側(cè)口角放入犬的口腔，用左手或繩子固定，右手持12號胃管由開口器的小圓孔向咽后壁方向不斷插入，導管另一端置于一杯清水中，若連續(xù)出現(xiàn)氣泡，說明插入呼吸道，應立即拔出胃管，重新操作。如無氣泡，說明沒有插入氣管，插至約20cm，即可到達胃內(nèi)。犬的灌藥量為每只每次200-500mL。犬的灌胃給藥法各種動物一次灌胃能耐受的最大容積動物種類體重（g）最大容積（ml）動物種類體重（g）最大容積（ml）小鼠20-241.0豚鼠250-3004-525-301.5>3006.0>302.0兔2kg-2.4kg100大鼠100-1993.02.5kg-3.5kg150200-2494-5>3.5kg200250-3006.0貓2.5kg-3.0kg50-80>3008.0>3.0kg100-050犬10kg-15kg200-500注射法注射法有皮下注射、腹腔注射、靜脈注射、肌肉注射以及皮內(nèi)注射、腦內(nèi)注射等。藥物吸收速度：靜脈注射＞腹腔注射＞肌肉注射＞皮下注射。皮內(nèi)注射常用于觀察皮膚血管通透性變化或反應，如過敏試驗腦內(nèi)注射常用于病毒學接種靜脈注射大小鼠尾靜脈和足背正中靜脈注射尾靜脈大小鼠尾靜脈注射豚鼠陰莖靜脈注射豚鼠足背正中靜脈注射兔耳緣靜脈注射犬前肢頭靜脈和后肢小隱靜脈注射其它途徑給藥方法呼吸道給藥：皮膚給藥：脊髓腔內(nèi)給藥：4.腦內(nèi)給藥：5.直腸內(nèi)給藥：6.關節(jié)腔內(nèi)給藥：動物間以及動物與人之間

給藥等效劑量的換算在藥理學毒理學上常涉及到給動物多少劑量的問題：不同種屬動物間的劑量換算動物與人之間的劑量換算人與動物間的計量換算等效劑量：不同動物間或動物與人之間可能產(chǎn)生相同藥效的劑量。等效劑量與單位體重的動物體表面積成正比小鼠b大鼠b地鼠b豚鼠b兔b比格犬b獼猴b成人b標準體重0.0200.1500.0800.41.810.03.060.0小鼠a1.000.500.600.3750.250.1500.250.081大鼠a2.001.001.200.750.500.300.500.162地鼠a1.671.201.000.6250.4170.250.4170.135豚鼠a2.671.331.601.000.6670.400.6670.216兔a4.002.002.401.501.000.601.000.324比格犬a(chǎn)6.673.334.002.501.671.001.670.541獼猴a4.002.002.401.501.000.601.000.324人a12.336.177.404.633.081.853.081.00表1.標準體重動物由動物a到動物b的mg/kg換算系數(shù):劑量×換算系數(shù)動物劑量換算成人劑量：例1：已知150g大鼠用5mg/kg，換算成成人的用藥劑量：查表大鼠a行，成人b列的換算系數(shù)為0.162，故成人的劑量=5×0.162=0.81mg/kg。一種動物劑量換算成另一種動物劑量：例2：已知20g小鼠用4mg/kg，換算成8kg比格犬的用藥劑量：查表小鼠a行，比格犬b列的換算系數(shù)為0.15，故比格犬的劑量=4×0.15=0.60mg/kg非標準動物的換算非標準動物換算成標準動物：給藥劑量×校正系數(shù)Sa×換算系數(shù)標準動物換算成非標準動物：給藥劑量×換算系數(shù)×校正系數(shù)Sb非標準動物換算成非標準動物:給藥劑量×校正系數(shù)Sa×換算系數(shù)×校正系數(shù)Sb例3：長期毒性試驗350g大鼠用10mg/kg，換算成8kg比格犬的用藥劑量：查表2，350/150=2.3，校正系數(shù)Sa=1.301。再查表1大鼠a行，比格犬b列的換算系數(shù)為0.30，故8kg比格犬的劑量=10×1.301×0.30=3.90mg/kgB=W/W標校正系數(shù)Sa校正系數(shù)Sb0.30.6691.4940.40.7371.3570.50.7941.2600.60.8431.1860.70.8881.1260.80.9281.0770.90.9651.0361.01.0001.0001.11.0320.9691.21.0630.9411.31.0910.9161.41.1190.8941.51.1450.8741.61.1700.8551.71.1930.8381.81.2160.8221.91.2390.8072.01.2600.7942.21.3010.7692.41.3390.7472.61.3750.7272.81.4090.7093.01.4420.6933.21.4740.679表2.非標準體重動物的校正系數(shù)（一）采血法大小鼠剪尾尾靜脈切割大鼠后肢足中靜脈采血眼眶后靜脈叢采血摘眼球采血腋窩動靜脈采血心臟采血腹主動脈采血七、實驗動物體液的采集方法心臟采血眼眶后靜脈叢采血足背正中靜脈采血腹主動脈采血小鼠頜下靜脈采血法大小鼠不同采血方法的比較采血方法采血量（ml）應用小鼠大鼠斷頭采血法0.2-1.01.5-5.0大批動物集中處死采血，速度快摘眼球采血法0.2-1.51.0-8.0大批動物集中采血，若一次少量采，可反復幾次尾靜脈切割采血法0.01-0.050.1-0.5用于用血量少的檢驗，如血常規(guī)，能長時期反復多次采血眼眶后靜脈采血法0.02-0.10.2-1.0能反復多次采血腋窩動靜脈采血法0.5-1.51.0-5.0需處死動物，麻醉后采血心臟采血法-0.2-1.0腹主動脈采血法-5.0-10.0需處死動物，麻醉后采血豚鼠心臟采血兔耳緣靜脈采血兔心臟采血兔頸總動脈采血一個動物到底能采多少血，取決于動物的體重、定期活體采血還是處死采血。動物的全血量為動物體重的8%左右，其中約30%儲藏在全身毛細血管內(nèi)。全血中約50%是有形成分。據(jù)此可測算處死后的采血量和血清量。采血為全血量的10%時，兩個星期恢復；采血為全血量的30%時，將危及生命。血清和血漿的區(qū)別不同的實驗對血液樣品的要求不同，有的要求全血，有的要求血清或血漿。血清是指血液凝固后析出的淡黃色的液體，血漿是指血液經(jīng)過抗凝后去除有形成份后的淡黃色液體。血清和血漿的區(qū)別在于血清中不含纖維蛋白，而血漿中含有與凝血有關的許多酶原和纖維蛋白原。常用的抗凝劑有肝素、枸櫞酸鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）鈉鹽或鉀鹽。各種實驗動物活體安全采血量和致死采血量動物種類最大安全采血量（ml）最小致死采血量（ml）小鼠0.30.5大鼠25豚鼠510兔1040犬50300猴1560（二）采尿法反射排尿法代謝籠法導尿法膀胱穿刺法兔采糞尿比格犬采糞尿大鼠采糞尿八、實驗動物常用處死方法安死術的概念“安死術”是指以人道的方法處死動物的過程。在處死動物過程中減少動物的驚恐或焦慮，安靜地、無痛苦地死亡。采用安死術必須符合的標準死亡時沒有驚恐、疼痛的表現(xiàn)使其在最短時間內(nèi)失去意識，迅速死亡方法可靠且可重復對操作人員安全采用的方法要與研究要求和目的一致對觀察者和操作者的情緒影響最小對環(huán)境污染的影響最小設備簡單、價廉、易操作處死動物地點應遠離，并與動物室隔開㈠大鼠小鼠1.頸椎脫臼法2.急性失血法3.麻醉致死法4.氣體窒息致死法㈡貓、犬、兔1.空氣栓塞法優(yōu)點：方法簡單、迅速，缺點：由于動物死于急性循環(huán)衰竭，各臟器凝血十分明顯。2.急性失血法先行麻醉，再分離頸動脈或股動脈，將一根較粗的塑料管插入動脈內(nèi)放血。動物在3～5min內(nèi)即可死亡。優(yōu)點：動物十分安靜，對臟器無損傷，對活殺采集病理切片標本是一種比較好的方法。3.化學藥物致死法通過注射一定量的化學藥物而使動物迅速致死。常用的化學藥物有：⑴10％氯化鉀溶液：靜脈注射，用量為犬20～30ml/只，兔5～10ml／只。⑵10％福爾馬林：靜脈注射，用量為犬20ml／只。大小鼠安樂死法豚鼠二氧化碳窒息法九、動物實驗后的護理1.麻醉蘇醒前注意保溫保持呼吸道通暢定時觀察記錄動物的生命體征2.創(chuàng)口處理徹底清創(chuàng)處理，必要時放置引流條可以不用敷料覆蓋創(chuàng)口3.抗菌素治療4.飲食和輸液大手術后適當輸液能加快恢復犬、猴手術后給與高蛋白、高能量飲食十、動物活體解剖、臟器稱重

及病理取材方法動物實驗后進行活體解剖是動物實驗最后一個重要步驟，通過活體解剖和病理學觀察，可以分析藥物的作用、各器官病變特點，觀察實驗效果，為分析實驗結(jié)果提供大體病理和組織病理學依據(jù)?；铙w解剖程序體表檢查胸腹部皮下檢查腹腔檢查胸