藥物不良反應(yīng)的研究進(jìn)展

對于不易清洗或多劑量包裝的滴眼液和注射劑，確保無菌和穩(wěn)定，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?，如?zhèn)毒劑和抗氧劑。使用抑菌劑和抗氧劑雖然增強(qiáng)了制劑的穩(wěn)定性但是在安全性和順應(yīng)性方面造成了不良影響,現(xiàn)就注射劑和滴眼劑中抑菌劑和抗氧劑的使用情況及檢測方法進(jìn)行闡述。1添加抑菌劑的必要性在藥物制劑中關(guān)鍵的問題是保持安全、穩(wěn)定、有效,同時兼顧順應(yīng)性,因此制劑處方應(yīng)盡量簡單,避免制劑組分之間的相互影響,提高安全性。無菌是安全性指標(biāo)之一,對于某些要求無菌的制劑(如眼用制劑和注射劑),為了達(dá)到無菌的要求必須進(jìn)行滅菌。但是對于不能耐受高溫滅菌(如蛋白類藥物)以及多劑量包裝的制劑(如大部分滴眼劑和某些注射劑),添加抑菌劑就成為必需。對于易于氧化變質(zhì)的藥物(含有醛、醇、酚、多羥基、雙鍵、共軛等官能團(tuán)的藥物)為了保持其穩(wěn)定性,同時為了用藥安全,添加抗氧劑也成為必需。1.1苯甲酸酯類、醇類目前常用的抑菌劑分為5類:(1)有機(jī)汞類;(2)季銨鹽類;(3)對羥基苯甲酸酯類;(4)醇類;(5)酸類。其中有機(jī)汞類包括硫柳汞、硝酸苯汞、醋酸苯汞等;季銨鹽類包括苯扎氯銨、苯扎溴銨等;對羥基苯甲酸酯包括羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯等;醇類包括三氯叔丁醇、苯甲醇等;酸類常用的為苯甲酸、山梨酸等。常見抑菌劑用量及實(shí)例見表1。抑菌劑的作用機(jī)理有以下幾種:使病原微生物蛋白質(zhì)凝固或變性;對微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜產(chǎn)生作用;作用于微生物體內(nèi)的酶系,與病原微生物酶系結(jié)合,抑制酶的活性,從而影響或阻斷其新陳代謝。其中硫柳汞能抑制細(xì)菌的巰基酶系統(tǒng),使細(xì)菌蛋白凝固,具有強(qiáng)烈的殺菌作用;苯扎氯銨、苯扎溴銨使菌體蛋白或蛋白質(zhì)類物質(zhì)凝固,阻止細(xì)胞的代謝;羥苯酯類通過破壞多孔通道、改變膜的pH值梯度或膜兩側(cè)的電荷電勢等方式,抑制營養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,從而抑制微生物的生長。1.2抗氧劑及其應(yīng)用氧化反應(yīng)是導(dǎo)致藥物的不穩(wěn)定因素之一。氧化降解大多是自由基的自氧化過程,這一過程僅需很少的氧即可引起反應(yīng),藥物在室溫下就能發(fā)生自氧化反應(yīng)。光、熱、微量的金屬離子或過氧化物都可以加速或催化該反應(yīng)。分子結(jié)構(gòu)中具有酚羥基或潛在酚羥基等有效成分的制劑中,極易引起藥物自氧化反應(yīng)。藥物氧化后,一方面有效成分含量降低,另一方面可能出現(xiàn)變色或沉淀,甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì),影響制劑的質(zhì)量。在自氧化過程中,自由基和氫過氧化物是加速氧化的關(guān)鍵,抗氧劑的作用就是抑制或消除自由基或氫過氧化物。根據(jù)這個思路,抗氧劑包括使用可以俘獲自由基的酚類,以及可以轉(zhuǎn)移自由電子使酚類再生的鄰羥基肉桂酸酯化合物;氫過氧化物分解劑硫化物、硫酯和亞磷酸酯類;金屬離子絡(luò)合劑EDTA;pH調(diào)節(jié)劑檸檬酸、酒石酸、乳酸等。2010版《中國藥典》中明確提出的抗氧劑為0.1%~0.2%的亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉。在實(shí)際處方研究中也可能用到其他高效、低毒、性質(zhì)穩(wěn)定的抗氧劑。利福平滴眼液主要用于治療沙眼、角膜炎、結(jié)膜炎等,療效較好。其藥物結(jié)構(gòu)中含有1,4-萘二酚結(jié)構(gòu),在堿性條件下易氧化形成相應(yīng)的醌型衍生物,影響藥效,故需加入抗氧劑如維生素C,以防止制劑氧化變質(zhì),增加其穩(wěn)定性。作為抗氧劑加入的維生素C,它本身是一個多元羥基酮酸的內(nèi)酯,易被光、熱、氧氣所氧化破壞,因此維生素C注射液,需要加入比維生素C還原性更強(qiáng)的抗氧劑,如焦亞硫酸鈉、L-半胱氨酸。再如中藥葛根素注射液,葛根素為8-β-D-葡萄吡喃糖-4,7-二羥基異黃酮,其結(jié)構(gòu)中含有酚羥基,易于氧化,在貯存過程中pH下降,顏色變黃,含量下降,選用濃度為0.1%的硫脲作為抗氧劑可以保持該制劑的穩(wěn)定。常見抗氧劑用量及應(yīng)用實(shí)例見表2。2苯扎氯銨用量抑菌劑作用并非僅限于微生物,滴眼劑中的抑菌劑甚至可能造成眼表損害。苯扎氯銨作為最常用的眼用制劑的抑菌劑,60%以上眼用制劑中都含有它,早在20世紀(jì)40年代就被用作隱形眼鏡藥水中的抑菌劑使用,但是頻頻發(fā)生的淚液膜厚度變薄、黏膜層損傷、過敏反應(yīng)以及干眼病等問題,讓人們重新審視和考慮是否應(yīng)該在處方中加入。DeSaintJeanM等進(jìn)行試驗(yàn),將Chang氏結(jié)膜細(xì)胞浸入濃度為1×10-6~1.0×10-3μg·mL-1苯扎氯銨溶液,10min后取出,置于一般細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境,不同時刻檢查細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能,結(jié)果顯示:苯扎氯銨溶液濃度為0.05%~0.1%時,細(xì)胞立即溶解;濃度為0.01%時,細(xì)胞24h內(nèi)全部死亡,顯示凋亡特征;濃度為1.0×10-6μg·mL-1~5.0×10-5μg·mL-1時,細(xì)胞生長明顯受到抑制,凋亡細(xì)胞數(shù)24~72h內(nèi)與濃度成正相關(guān);濃度為1.0×10-5μg·mL-1~1.0×10-4μg·mL-1時,結(jié)構(gòu)正常的細(xì)胞,形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果細(xì)胞以及細(xì)胞核都變小,染色質(zhì)密集,凋亡標(biāo)記物高度表達(dá),且表達(dá)程度與細(xì)胞膜是否完整無關(guān),而與苯扎氯銨溶液的濃度正相關(guān)。Debbash等做了類似的實(shí)驗(yàn),將Chang氏結(jié)膜細(xì)胞浸入0.1%、0.25%、0.4%硫柳汞和1×10-6~1.0×10-3μg·mL-1苯扎氯銨溶液15min,取出后檢測細(xì)胞活力、線粒體活力、胞內(nèi)谷胱甘肽、DNA濃集以及活性氧簇產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)非季銨鹽抑菌劑產(chǎn)生的氧化應(yīng)激以及因此所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡率明顯低于季銨鹽抑菌劑苯扎氯銨。Becquet等研究了常規(guī)濃度下常用抑菌劑羥苯酯類、硫柳汞等對結(jié)膜組織的病理影響,一個月后進(jìn)行單克隆抗體作組織學(xué)和免疫學(xué)檢查,結(jié)果發(fā)現(xiàn):上皮細(xì)胞角質(zhì)化以及結(jié)膜實(shí)質(zhì)層、上皮層、角膜緣部位炎癥浸潤等角膜結(jié)膜損害,與抑菌劑種類之間無明顯差異。既要保證制劑的穩(wěn)定性又不能降低藥物的安全性,抑菌劑的添加就成為關(guān)鍵。各國藥典中均對此問題有所關(guān)注,《美國藥典》首先就抑菌劑的抑菌效力提出了抑菌劑效力檢查;《中國藥典》2010版也增加了抑菌劑效力檢查法指導(dǎo)原則,要求制劑中抑菌劑的量應(yīng)為最低有效量,具有抗菌活性的制劑在藥物研發(fā)階段均應(yīng)確認(rèn)其抗菌效力。解決這種問題的最直接辦法就是不添加抑菌劑。根據(jù)Baodouin的論述,在眼科慢性病如青光眼或干眼病患者使用中,不添加抑菌劑的多劑量包裝眼用制劑雖然可能更易被污染,在開封后10h即有污染風(fēng)險,但實(shí)驗(yàn)表明僅有約2%的瓶裝滴眼劑受到影響。另外,即便添加了苯扎氯銨,在15天后仍有34.8%的滴眼劑被污染。不僅如此,還有一些細(xì)菌能夠耐受苯扎氯銨,甚至在苯扎氯銨溶液中生長。因此添加抑菌劑也未必能夠切實(shí)保證制劑在長期使用和放置過程中的穩(wěn)定性。目前研發(fā)的新型多劑量包裝采用多孔膜過濾或吸附抑菌劑,或是采用防止細(xì)菌侵入貯器的單向閥系統(tǒng)。抗氧劑方面,孟紫強(qiáng)、魏彩玲等用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了焦亞硫酸鈉對大鼠背根節(jié)(DRG)鉀電流、鈉電流、L-鈣電流的影響,結(jié)果表明,焦亞硫酸鈉對鉀電流、鈉電流和L-型鈣電流的增加具有劑量和電壓雙重作用,極低劑量的焦亞硫酸鈉即可使神經(jīng)細(xì)胞的興奮性增加,導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電。DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鉀離子濃度的變化可激活誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的半胱氨酸天冬酶和核酸酶;DRG神經(jīng)元胞內(nèi)鈉離子和鈣離子的異常變化可導(dǎo)致神經(jīng)性疼痛。另有研究顯示,亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉對人胚腎細(xì)胞、人胚肺細(xì)胞、肝細(xì)胞等有明顯毒性作用。Shigehara等對亞硫酸鹽的研究結(jié)果表明,亞硫酸鹽可通過β2-整聯(lián)蛋白Mac-1使多形核中性白細(xì)胞粘附于固定化纖維蛋白原,導(dǎo)致Mac-1不能正常表達(dá),從而導(dǎo)致人體炎癥反應(yīng)。Eisen等的研究結(jié)果表明,亞硫酸氫鈉可逆的抑制鞘磷脂酶和磷脂酶C,以及小鼠肝溶酶體和巨噬細(xì)胞中的酸性激活磷脂酶A,而磷脂酶C是產(chǎn)生第二信使三磷酸肌醇的關(guān)鍵酶,第二信使是生物學(xué)反應(yīng)的重要物質(zhì),因此抑制磷脂酶C會影響到正常的生命活動;磷脂酶A2與多種急慢性炎癥反應(yīng)有關(guān),是炎性介質(zhì)產(chǎn)生的限速酶。因此亞硫酸氫鈉一定程度上會引起炎癥的產(chǎn)生。Rencüzogullari等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),75μg·mL-1的焦亞硫酸鈉即可引起染色體畸變以及姐妹染色單體交換,當(dāng)濃度達(dá)到150μg·mL-1時,復(fù)制及有絲分裂指數(shù)均有所下降,這種現(xiàn)象呈劑量依賴性,濃度越高,復(fù)制指數(shù)和有絲分裂指數(shù)下降越劇烈。Carvalhod等也在焦亞硫酸鈉的遺傳毒性方面進(jìn)行了研究,單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)和微核檢查實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,焦亞硫酸鈉確具遺傳毒性。3苯扎溴銨雙硫滴定法由于抑菌劑的抑菌作用和毒性同時存在,所以必須對其含量進(jìn)行檢測,目前《中國藥典》要求檢查滴眼劑中抑菌劑的品種有6個,分別為硫酸新霉素滴眼液和妥布霉素滴眼液中的羥苯乙酯、羥苯丙酯和苯扎氯銨;氯霉素滴眼液中羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯;諾氟沙星滴眼液中硫柳汞、羥苯甲酯、羥苯丙酯;鹽酸環(huán)丙沙星滴眼液中苯扎溴銨、羥苯乙酯;氧氟沙星滴眼液中苯扎溴銨。以上抑菌劑品種需要檢查,所采用的方法除硫柳汞為雙硫腙滴定法外,其它均為高效液相色譜法。文獻(xiàn)中有采用高效液相色譜法檢測硫柳汞的報道,結(jié)果表明峰面積與濃度線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r=0.99999),方法靈敏準(zhǔn)確。USP34中對抑菌劑的檢查分為兩部分:一般氣相色譜法(GeneralGasChromatographymethod)和極譜法(Polarographicmethod)。氣相色譜法給出了苯甲醇、三氯叔丁醇、苯酚、羥苯甲酯和羥苯丙酯的一般氣相色譜檢測方法,可做定量檢查;極譜法可對硝酸苯汞和硫柳汞含量進(jìn)行檢查。《中國藥典》尚無制劑中抗氧劑的檢查方法,在藥典正文第二部分中對于焦亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉使用碘滴定法。文獻(xiàn)中有報道檢測焦亞硫酸鈉,絡(luò)合形成有色物質(zhì)后使用紫外分光光度法進(jìn)行檢測,濃度與吸收度呈線性相關(guān)。另有研究人員用高效液相色譜法檢測硫代硫酸鈉,結(jié)果與碘量法測得結(jié)果相近。4監(jiān)督檢查方法注射劑和滴眼劑作為常用的無菌制劑,其安全性和穩(wěn)定性必須放在同等重要的位置,添加抑菌劑和抗氧劑的目的是保證制劑免受微生物污染以及避免氧化變質(zhì),從而保證藥物的安全有效,同時必須注意抑菌劑和抗氧劑各自本身性質(zhì)所帶來的一定毒性,在使用中必須注意用量,既要達(dá)到添加的目的,又要使危害降至最低,因此必須建立有效的監(jiān)督檢查方法,常用的有高效液相色譜法、滴定