云錦杜鵑菌根真菌的分離

菌根是生物界最廣泛、最重要的共同異體。促進(jìn)不同生態(tài)系統(tǒng)之間的物質(zhì)交換、能量流動(dòng)和信息傳輸，以及生物的發(fā)育和分布，保護(hù)生物多樣性，穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)，保持生態(tài)平衡，可持續(xù)發(fā)展。我們可以促進(jìn)農(nóng)業(yè)、林業(yè)和畜牧業(yè)的生產(chǎn)，這對(duì)不可替代的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)具有深遠(yuǎn)意義。菌根研究是建立在菌物學(xué)和植物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上的交叉研究領(lǐng)域,近30年來(lái)進(jìn)展突飛猛進(jìn)。我國(guó)菌根研究主要涉及外生菌根、叢枝菌根和蘭科菌根等,許多研究結(jié)果達(dá)到或超過(guò)世界先進(jìn)水平。但是關(guān)于杜鵑花類菌根研究在我國(guó)尚未見(jiàn)到相關(guān)正式報(bào)道。杜鵑花科植物除野草莓屬(Arbutus)、熊果屬(Arctostaphylos)外,都有一種特殊類型菌根共生。菌絲侵入杜鵑花科植物根部細(xì)胞內(nèi)形成菌絲節(jié)結(jié)構(gòu)(Coil),HarleyJL.(1969)把這種特殊的菌根共生結(jié)構(gòu)命名為杜鵑花類菌根(EricoidMycorrhiza,簡(jiǎn)稱為ERM),也稱為歐石楠菌根。現(xiàn)在許多研究表明杜鵑花類菌根在杜鵑花科植物的營(yíng)養(yǎng)吸收、逆境生理、生態(tài)適應(yīng)性等方面具有重要作用,其真菌群體多樣性和功能研究在國(guó)外受到廣泛的關(guān)注。而且人工接種菌根真菌可以增加擬歐石楠、越桔等杜鵑花科植物的抗逆性、生長(zhǎng)量等,因而此類菌根研究便具有了重要的園藝實(shí)踐意義。原產(chǎn)我國(guó)杜鵑花科植物很多是著名的觀賞植物,也有一些種類是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的水果。但這類植物在我國(guó)栽培應(yīng)用范圍和數(shù)量都很少,栽培中生長(zhǎng)不良是主要的限制因子。因此這類植物的菌根研究將會(huì)促進(jìn)我國(guó)的杜鵑花科植物應(yīng)用和發(fā)展。菌根真菌分離是杜鵑花菌根真菌研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)。杜鵑花科植物根系共同特征是由眾多的非常細(xì)弱須根(hairroot)組成,菌根真菌的分離比較困難。文獻(xiàn)報(bào)道的杜鵑花類菌根真菌的分離方法主要有根段離析法(組織單細(xì)胞分離法)和根段直接培養(yǎng)方法。其中以根段直接培養(yǎng)法使用較多,分離培養(yǎng)基采用土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、MMN、MEA培養(yǎng)基等。作者發(fā)現(xiàn)這些培養(yǎng)基在ERM菌株分離時(shí),菌落易于互相覆蓋,污染的幾率也比較高。因而,首次嘗試把馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基引入到ERM真菌分離中來(lái),并對(duì)其進(jìn)行改良,克服了以上培養(yǎng)基的不足。實(shí)驗(yàn)中結(jié)合根段直接培養(yǎng)法使用,使此類菌根真菌的分離更加簡(jiǎn)捷,便于操作。1材料和方法1.1材料表面1.1.1生活根的制備采取華頂山森林公園自然生境中云錦杜鵑(RhododendronfortuneiL)的生活根,連同泥土保濕放置在冰桶內(nèi),帶回實(shí)驗(yàn)室放在4℃冰箱保存待用。1.1.2紅染料、硫酸鎂、磷酸氫二鉀試劑胰蛋白胨為英國(guó)OXOID公司生產(chǎn);純化瓊脂粉、孟加拉紅染料、硫酸鎂、磷酸氫二鉀為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn),購(gòu)自上海試總試劑科技公司。鏈霉素、麥芽提取物(Sigma)購(gòu)自上海美季生物技術(shù)公司。1.1.3儀器三洋實(shí)驗(yàn)室用高壓自動(dòng)滅菌鍋;賽福恒溫恒濕培養(yǎng)箱HWS-350;萊卡光學(xué)顯微鏡LeicaDM2000。1.1.4鏈霉素添加量的確定分離培養(yǎng)基使用馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱MA),對(duì)其酸堿度進(jìn)行調(diào)整改良。配方為:葡萄糖10g、胰蛋白胨5g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂0.5g、孟加拉紅0.033g,瓊脂20g,蒸餾水定容至1000ml,調(diào)節(jié)pH值至5.0,然后121℃高壓滅菌20min,冷卻至60℃以下時(shí)加入0.03g鏈霉素,混合均勻,倒平板待用。MMN培養(yǎng)基配方參見(jiàn)XiaoG&BerchSM。鑒定培養(yǎng)基使用麥芽提取物培養(yǎng)基(MEA),配方為:麥芽提取物20g、胰蛋白胨1g、葡萄糖20g、瓊脂20g,蒸餾水定容至1000ml,然后121℃高壓滅菌20min,冷卻至60℃以下時(shí)加入0.03g鏈霉素。菌絲體鑒定使用土豆瓊脂培養(yǎng)基(PDA),配方及制作方法參見(jiàn)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。1.2菌株的準(zhǔn)備和培養(yǎng)菌根真菌的分離:從冰箱中取出材料,用自來(lái)水輕輕沖洗掉泥土,挑取健康的生活細(xì)根。清洗干凈后,用72%酒精沖洗一下,放于10%家用84消毒液中洗滌15～20min,無(wú)菌水沖洗3～5次后,剪切成0.3～0.5cm根段,每個(gè)培養(yǎng)皿中放置5個(gè)根段,然后置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～4w。共培養(yǎng)200個(gè)根段,20個(gè)馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基和20個(gè)MMN培養(yǎng)基平板。菌落形態(tài)和菌絲體顯微特征觀察:待菌落從根段中長(zhǎng)出來(lái),用牙簽挑取菌落至MEA培養(yǎng)基,繼續(xù)進(jìn)行菌落形態(tài)鑒定。每個(gè)菌落點(diǎn)6個(gè)菌斑,兩個(gè)平板,培養(yǎng)2周后觀察菌落形態(tài)的一致性和均勻性。若菌落形態(tài)有差異,進(jìn)行二次分離和鑒定。菌落形態(tài)特征穩(wěn)定的菌株用牙簽挑取至PDA平板25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2周,然后于4℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2周,光學(xué)顯微鏡100～400倍下觀察菌絲體形態(tài)和孢子形狀。菌根真菌無(wú)菌條件回接:2份草炭和1份蛭石混合高壓滅菌后分裝于無(wú)菌瓶,移栽無(wú)菌云錦杜鵑實(shí)生苗至瓶?jī)?nèi),并分別接種分離的菌株,置25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3個(gè)月后,剪取幼苗的根系錐蟲蘭染色,于光學(xué)顯微鏡下檢查真菌侵染狀況。2結(jié)果與分析2.1菌株生長(zhǎng)和分生孢子來(lái)源使用MMN與MA氏培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基,采用根段直接培養(yǎng)法從6棵云錦杜鵑須根中分離出生長(zhǎng)較緩慢菌株138個(gè),依據(jù)菌落在MEA培養(yǎng)基上的形態(tài)和菌絲體特征,可以將菌株分為9類。MEA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)14d各種類型的菌株特征和生長(zhǎng)速度見(jiàn)表1和圖1-9,PDA培養(yǎng)基上的菌絲體特征見(jiàn)表2和圖10～13。菌落分類特征的描述依據(jù)JohanssonM和McleanC.B等使用的方法。從表中結(jié)果可知:絕大部分菌落生長(zhǎng)緩慢,除一個(gè)類型外,其它8種菌株類型純培養(yǎng)都沒(méi)有見(jiàn)到分生孢子產(chǎn)生;9類菌株中的6類從馬丁氏和MMN培養(yǎng)基中都分離出來(lái)。2類菌株僅從MA培養(yǎng)基中得到,1類菌株僅從MMN培養(yǎng)基中得到,這三類菌株分別只有1個(gè)菌株,3種菌株占菌株總數(shù)的2.2%,從兩種培養(yǎng)基中都分離得到的菌株為分離總數(shù)97.8%。2.2細(xì)胞內(nèi)病原菌的確定根據(jù)分離菌株的類別隨機(jī)選擇50個(gè)菌株進(jìn)行云錦杜鵑試管苗菌根真菌回接試驗(yàn),確定分離菌株是否為菌根真菌。接種3個(gè)月后,取出植物根系,用錐蟲蘭染色壓片觀察根部細(xì)胞內(nèi)是否有菌絲侵入或形成菌絲圈結(jié)構(gòu)。表1中菌株類別1、2、3、4、5、6、7中的菌株均與云錦杜鵑幼苗根細(xì)胞內(nèi)形成了菌絲圈結(jié)構(gòu),也就實(shí)驗(yàn)證明這些菌株類別為杜鵑花類菌根真菌。MMN培養(yǎng)基和馬丁氏培養(yǎng)基分離均得到了這些菌株類型(見(jiàn)表1和圖1-9)。3菌株的篩選和分離根段離析法(組織單細(xì)胞分離法)和根段直接培養(yǎng)方法是ERM真菌分離常采取兩種處理根段的方法。其中以根段直接培養(yǎng)法使用較多,由于其操作簡(jiǎn)便,也是本試驗(yàn)中采用的根段處理方式。分離培養(yǎng)基的選擇影響真菌分離的效率、種類數(shù)量等,是真菌分離的基礎(chǔ)工作。SteinkeE.等采用WA(水瓊脂培養(yǎng)基)、MMN、PDA3種培養(yǎng)基從LeucopogonparviflorusAndr.根中分離ERM真菌,結(jié)果表明使用MMN、PDA分離出的ERM真菌種類最多,是合適的分離培養(yǎng)基。以后的文獻(xiàn)中有關(guān)ERM真菌的分離基本都采用這兩種培養(yǎng)基。作者在初期實(shí)驗(yàn)中也采用MMN和PDA培養(yǎng)基分離云錦杜鵑根系中的ERM真菌,發(fā)現(xiàn)在這兩種培養(yǎng)基上真菌生長(zhǎng)較快,菌斑容易互相覆蓋,且細(xì)菌和放線菌污染幾率較高,平板污染率達(dá)30～50%,給菌落的挑取帶來(lái)不便。后來(lái)嘗試使用改良馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基,同時(shí)使用MMN培養(yǎng)基作為對(duì)照進(jìn)行ERM真菌分離。MA培養(yǎng)基中的孟加拉紅染料對(duì)細(xì)菌和放線菌有毒害,鏈霉素能夠抑制或殺死細(xì)菌,并能夠抑制真菌菌落的過(guò)快生長(zhǎng),根據(jù)ERM真菌種類的不同,25℃培養(yǎng)14d菌落直徑在MMN上比在馬丁培養(yǎng)基上大0.1～1.0cm。這樣MA培養(yǎng)基就可以防止生長(zhǎng)較快的菌斑覆蓋相鄰菌斑,給生長(zhǎng)緩慢的杜鵑花類菌根真菌菌落的形成提供充足的時(shí)間。并且極大限度地避免了細(xì)菌和放線菌的污染,平板污染率降低到10%以下。一般培養(yǎng)時(shí)間15～20d內(nèi),各根段基本都能長(zhǎng)出菌落且相互獨(dú)立且形態(tài)特征較為突出,菌落的挑取可以一次完成,真菌分離效率大大提高,這是MA培養(yǎng)基根段直接培養(yǎng)法最突出的優(yōu)點(diǎn)。另外需注意馬丁氏-孟加拉紅培養(yǎng)基自然pH值為7.0左右,使用前加少許1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至5.0左右,這樣有利于ERM真菌的生長(zhǎng),否則會(huì)影響分離真菌的種類和數(shù)量。從分離菌株的結(jié)果看(表1和2),138個(gè)9類菌株,其中6類菌株使用MMN、MA培養(yǎng)基都分離得到,有2類菌株只從MA培養(yǎng)基中分離得到,1類僅從MMN培養(yǎng)基中分離得到。這3類菌株都分別只有1個(gè)菌株,很難判別是否由于培養(yǎng)基差異造成的。把3類菌株轉(zhuǎn)接在MMN、MA培養(yǎng)基上,2周后發(fā)現(xiàn)3類菌株都能在兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明兩種培養(yǎng)基分離菌株類型的差異是由于隨機(jī)誤差而不是菌株對(duì)培養(yǎng)基的選擇性造成的。分離菌株的菌落特征與從Rhododendronobtusumvar.KaempferiL.、CallunavulgarisL.等杜鵑花科植物根系中分離的菌根真菌菌落特征有些差異,而菌絲體顯微特征相似性較高。菌落的大小、顏色等常因培養(yǎng)環(huán)境、時(shí)間等有一定的改變,而顯微特征相對(duì)比較穩(wěn)定,作為分類特征可靠性較高,成為傳統(tǒng)的真菌分類標(biāo)準(zhǔn)。惟一產(chǎn)生分生孢子第2類菌株,其平板培養(yǎng)產(chǎn)生色素、菌絲、分生孢子特征與常見(jiàn)的ERM真菌類型樹粉孢屬Oidiodendron相似(見(jiàn)圖10),而且回接實(shí)驗(yàn)中也形成了云錦杜鵑根內(nèi)菌絲節(jié)結(jié)構(gòu),推測(cè)是樹粉孢屬的菌株。其他的6類菌株在PDA培養(yǎng)基上都沒(méi)有見(jiàn)到形成分生孢子,但菌絲體都或多或少形成菌絲束、菌絲節(jié)或厚垣孢子等ERM真菌常見(jiàn)的特征(見(jiàn)圖11～13),菌絲的直徑與JohanssonM.分離的ERM菌株也比較接近,而且回接云錦杜鵑也形成了菌根結(jié)構(gòu),并對(duì)植物幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)一定的促進(jìn)作用,說(shuō)明是杜鵑花菌根菌,但菌株分類尚需要進(jìn)一步研究。第8、9類菌株回接實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有形成菌根結(jié)構(gòu),菌株的數(shù)量也很少,總共3個(gè)菌株,可能是一些其它的土壤真菌類型。作者采用這種方法成功地對(duì)不同自然分布區(qū)的云錦杜鵑(R.fortun