突變型人APP基因與增強型綠色熒光蛋白基

因融合載體的構(gòu)建作者：張麗娟王鳳斌成敏劉蓉【摘要】目的構(gòu)建攜帶突變型人淀粉樣前體蛋白基因(APP695)與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因融合載體。方法在NCBI上查找APP695的序列，設(shè)計引物。以pCB6質(zhì)粒攜帶的野生型APP695序列為模板，以突變體引物擴增突變型APP695。將突變型APP695與pIRES2EGFP連接并測序證實。結(jié)果經(jīng)過酶切鑒定、PCR和DNA測序等方法，證實構(gòu)建的pIRES2EGFP/APP695突變型質(zhì)粒載體序列正確。結(jié)論成功構(gòu)建APP695 EGFP融合基因載體，為研究AD發(fā)病的分子機制和治療時的藥物篩選奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】瑞典突變APP695；增強型綠色熒光蛋白；APP695EGFP融合基因；載體【Abstract】 ObjectiveToconstructandexpressarecombinantvectorbearingfusiongeneofhumanamyloidprecursorprotein(APP)695mutantgeneandenhancedfluorescenceprotein(EGFP)fusiongene.MethodsTheprimersweredesignedaccordingtothesequencesofAPP695genefoundfromNCBI.ThenthemutantAPP695wasamplifedbyPCRwithpCB6carryingwildhumanAPP695andactingasatemplate,thegeneofmutantAPP695wasligatedtopIRES2EGFP.TherecombinantplasmidofpIRES2EGFP/APP695mutantwasverfiedbycheckingsequences.ResultsTheexactsequencesofpIRES2EGFP/APP695mutantvectorwereconfirmedbydigestionofrestrictionendonucleases,PCRandsequencing.ConclusionsThepIRES2EGFPAPP695mutantfusiongenerecombinationhasbeenconstructedsuccessfully,whichlaysthefoundationforfurtherresearchofADpathogenesisandscreeningnewdrugtargetsonADtherapy.【Keywords]SwedishmutantAPP695；EGFP；FusiongeneofhumanAPP695/EGFP;Vector淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)基因是Alzheimer病(AD)已發(fā)現(xiàn)的諸多相關(guān)基因之一。APP基因某些位點的突變可以引發(fā)某些家族的早發(fā)性AD,故APP的突變在AD發(fā)病中的作用引起了廣泛關(guān)注。本研究應(yīng)用增強型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)作為報告基因，將APP695突變基因與其融合，構(gòu)建突變型APP695 EGFP融合基因載體，為進一步研究APP695突變在AD發(fā)病中的作用，以及篩選對AD有治療作用的藥物奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料攜帶野生型人類APP695的pCB6質(zhì)粒，由美國加利福尼亞大學(xué)細(xì)胞分子醫(yī)學(xué)院許華熙博士惠贈。攜帶EGFP的pIRES2質(zhì)粒載體，由濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室保存,DH5a感受態(tài)細(xì)胞為濰坊醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室凍存。NheI、Hindlll、SmaI、XbaI等限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶與TaqDNA聚合酶，引物等均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司。1.2方法1.2.1pIRES2EGFP APP695融合基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建將攜帶EGFP的pIRES2質(zhì)粒載體用NheI、Hindlll酶切后，采用PCR擴增突變型APP基因，用Premier5軟件設(shè)計PCR引物，以pCB6 APP695野生型質(zhì)粒載體DNA作為模板，PCR擴增突變APP基因。引物序列為：TA1APPU:5'attgctagcatgctgcccggtttggc