一、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的概念？在體外對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)并進(jìn)行研究的技術(shù)，也叫細(xì)胞克隆技術(shù).細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中最核心、最基礎(chǔ)的技術(shù)。二、 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)？?jī)?yōu)點(diǎn)：1、 得到的是活細(xì)胞：能長(zhǎng)時(shí)間、直接觀察、研究活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動(dòng)2、 可控制：可控制-選擇對(duì)象：類型：上皮？間質(zhì)？性質(zhì)：正常？腫瘤？可控制-調(diào)節(jié)條件：各種因素如物理、化學(xué)、生物等因素3、 應(yīng)用廣學(xué)科多；對(duì)象廣：各種動(dòng)物：低等動(dòng)物--高等動(dòng)物--人類一種動(dòng)物：不同年齡不同組織：正常或異常（腫瘤）4、 較經(jīng)濟(jì)花錢較少但可得到大量、同時(shí)、重復(fù)性好的生物學(xué)性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象5、 不易污染環(huán)境缺點(diǎn)：現(xiàn)人工無法完全模擬體內(nèi)環(huán)境失去彼鄰關(guān)系失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞相互間的影響細(xì)胞趨向單一化失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)分化減弱或不顯要正確認(rèn)識(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞是一種特定條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞群體。某些類型細(xì)胞還很難培養(yǎng)大規(guī)模培養(yǎng)難度大三、 體外細(xì)胞培養(yǎng)的方式及特點(diǎn)？1、 粘附型培養(yǎng)：附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。粘附是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)外生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式懸浮型培養(yǎng)：不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。來源：來自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞多見，癌腫細(xì)胞也可以。特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好，細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)。優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便（不需消化），易于收獲可獲得穩(wěn)定狀態(tài).缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)（尤以正常細(xì)胞）四、 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)分類？1、 上皮樣細(xì)胞來源：來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞如：皮膚及其衍生物，消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核易相連成片相靠一緊密相連一成薄層一鋪石狀2、 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似來源：中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形

胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起中有卵圓形核3、其他，不定型樣細(xì)胞五、解釋下列常用術(shù)語：1）.細(xì)胞系（cellline）：2）,細(xì)胞株：3）.原代培養(yǎng)：4）.傳代培養(yǎng)：5）.轉(zhuǎn)染（transfection）:6）.lipofection：細(xì)胞系（cellline）：原代培養(yǎng)物首次傳代后，就可以稱細(xì)胞系。不能或有限傳代下去稱有限細(xì)胞系。能連續(xù)傳代的稱連續(xù)細(xì)胞系。細(xì)胞株：某類細(xì)胞經(jīng)傳代克隆并保持了該類細(xì)胞理化特征的細(xì)胞群體。原代培養(yǎng)：直接取自生物體的組織細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)物內(nèi)分散到另一個(gè)培養(yǎng)物的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：將某個(gè)基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細(xì)胞核內(nèi)。6.lipofection:常用細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑（脂質(zhì)體），它搭載基因（DNA）后形成復(fù)合物可轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞。六、 細(xì)胞培養(yǎng)的條件及設(shè)備？1、 細(xì)胞培養(yǎng)室2、 常用設(shè)備（超凈臺(tái)、純水裝置、抽氣泵、消毒裝置、CO2培養(yǎng)箱、干燥裝置、液氮生物容器、冰箱、離心機(jī)、顯微鏡、天平、過濾裝置、空調(diào)、酸度計(jì)）3、常用消耗器材 培養(yǎng)瓶、各種相關(guān)玻璃用品、塑料用品、棉制品、手術(shù)器材4、培養(yǎng)用液 天然培養(yǎng)基（液）：血清、雞胚浸出液、鼠尾膠人工合成培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)基、平衡鹽溶液、緩沖液、蒸餾水、消化液和抗菌素等七、 原代培養(yǎng)技術(shù)的過程？1、 取材超凈臺(tái)外酒精消毒乳鼠（用鑷子夾住乳鼠尾巴，在酒精里旋轉(zhuǎn)3s）——乳鼠進(jìn)入超凈臺(tái)，固定乳鼠一一消毒皮膚（碘酒消毒一次，酒精消毒兩次，一次比一次范圍小，從中間向周圍打圈消毒）一一撕開皮膚，暴露胸廓（第一套器械，兩把鑷子）一一消毒胸廓（酒精消毒兩次）一一開胸（第二套器械，一把剪刀，一把鑷子）一一取心肺組織（第三套器械，一把鑷子）2、 漂洗Hanks漂洗（三塊組織一起漂洗）3、 剪切粗剪（第三套器械，一把剪刀）——Hanks液漂洗——細(xì)剪——Hanks漂洗4、 接種加全培1mL，吸管吸取接種接種后，從培養(yǎng)瓶的側(cè)面加入適量全培，接種面朝上，放入孵箱，30min后，翻瓶培養(yǎng)。八、 傳代培養(yǎng)技術(shù)過程？換液：半換液貼壁細(xì)胞用吸管吸取一半培養(yǎng)液再加半換液貼壁細(xì)胞用吸管吸取一半培養(yǎng)液再加入等體積新的培養(yǎng)液離心，棄去一半培養(yǎng)液，再加入等體積新培養(yǎng)液全換液 直接倒掉培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液 離心，棄去所有上清，加入新培養(yǎng)液傳代：1、倒去原培養(yǎng)液，用1mLHanks漂洗一遍;2、 消化。倒去Hanks液，向培養(yǎng)瓶無細(xì)胞面加入0.5mL胰蛋白酶液，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液浸泡細(xì)胞面，立即倒去消化液，再加入0.5mL的胰蛋白酶液，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化變化。當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞趨向圓球形、細(xì)胞間隙增大時(shí)，立即終止消化。終止消化的方法是：加基礎(chǔ)培養(yǎng)液或Hanks1mL，用吸管頭輕輕地、有序地吹打瓶壁細(xì)胞，細(xì)胞從支持物上脫落，并彼此分離懸浮于水中，液體混濁。將消化下來的細(xì)胞歸入離心管中，離心去上清液。3、 分瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。離心沉淀細(xì)胞加少量完全培養(yǎng)液，混勻，分別接種到兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中。每瓶再補(bǔ)加一些全培，輕輕吹打混勻，放入孵箱中培養(yǎng)。九、每代細(xì)胞基本的生長(zhǎng)過程？游離期：細(xì)胞接種后最初一段時(shí)間，細(xì)胞在培養(yǎng)基中呈懸浮狀，胞體圓形.貼壁期：細(xì)胞附著于支持物上離心：促進(jìn)附著；流動(dòng)：培養(yǎng)液流動(dòng)可阻止細(xì)胞附著；低溫：可抑制附著潛伏期：細(xì)胞活著但無分裂.細(xì)胞株6—24h原代24—96h指數(shù)增長(zhǎng)期：細(xì)胞增殖旺盛，數(shù)量成倍增多，最適合實(shí)驗(yàn)研究.3—5d以后來到.停止期（衰退期）細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁，有活力，不增殖，能存活一段時(shí)間.如傳代進(jìn)入下一循環(huán).十、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用？1細(xì)胞遺傳學(xué)2細(xì)胞內(nèi)蛋白、酶及其它物質(zhì)的定性、定量分析（細(xì)胞化學(xué)、免疫組化和熒光定量等）3分子生物學(xué).DNA分離、分析基因?qū)牖虮磉_(dá)的原位檢測(cè)4、 生物技術(shù)疫苗的制備細(xì)胞工程抗體5、 藥物開發(fā)藥理、毒力和藥效試驗(yàn)6、 細(xì)胞分化如干細(xì)胞研究7、 腫瘤學(xué)研究發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化等8、 細(xì)胞衰老、凋亡9、 其他密度抑制：細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。膽固醇基酯轉(zhuǎn)移蛋白（CETP）抑制劑，因CETP基因分子缺陷使得CETP不足者其血漿HDL-C水平顯著增高，從而導(dǎo)致了抑制CETP可能是增高HDL-C水平新方法的理論。細(xì)胞生長(zhǎng)有密度抑制血清可降低密度抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞可降低密度抑制物品清洗：1、玻璃制品舊：煮沸10min一刷洗一一振蕩沖洗15-20遍——烤干一一泡酸——振蕩沖洗15-20遍一蒸餾水浸泡兩次（每次24h）——烤干——包裝新：5%鹽酸過夜一一振蕩沖洗15-20遍一一蒸餾水浸泡兩次（每次24h）——烤干一一包裝2、 橡膠制品新：0.5MNaOH浸泡過夜——流水沖洗15-20遍——0.5MHCL浸泡15min——流水沖洗15-20遍——自來水煮沸2次——蒸餾水煮沸5-10min——50°C烤干舊：煮沸10min 刷洗 流水沖洗15-20遍 蒸餾水煮沸5-10min 50C烤干3、 塑料制品刷洗一一流水沖洗15-20遍一一蒸餾水浸泡2次（24h/換水）——烤干備用細(xì)胞凍存：基本原則——慢凍快融細(xì)胞凍存液配方：全培：血清：DMSO=7:2:1或血清：DMSO=9:11、 準(zhǔn)備10%細(xì)胞凍存液和待凍細(xì)胞。2、 消化后的細(xì)胞懸液離心去上清，沉淀加細(xì)胞凍存液，輕輕吹打，將細(xì)胞懸液分裝于2ml凍存管中（分裝時(shí)，使用有膠墊的凍存管），每管1mL,擰緊，標(biāo)記凍存的細(xì)胞名稱和日期。3、 梯度降溫凍存（1） 程序冷凍：細(xì)胞冷凍儀每分鐘下降1C，-30C，或—40C時(shí)，每分鐘5?10C的速度下降，—70C時(shí)投入液氮中。（2） 手工方法：4C，30min—冰水（0C）10minf-20C，30minf-70C，過夜一次晨投入液氮。消化 離心 凍存液重懸 分裝［mL/支 梯度降溫（4C，30minf冰水（0C）10min一一20C，30minf-70C，過夜一次晨投入液氮）爬片傳代：六孔板1個(gè)蓋玻片/孔——消化并收集細(xì)胞（離心）一一重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液（1mL全培）——接種細(xì)胞（每孔約300uL/蓋玻片），靜置5min——加全培（1） 胰酶消化細(xì)胞離心后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基（1mL）中。（2） 將蓋玻片放入六孔板中，每孔一片蓋玻片，將1mL單細(xì)胞懸液分成三份滴加在蓋玻片的中心（盡量接種在蓋玻片的中心），靜置5min。整個(gè)過程注意無菌操作。（4） 待細(xì)胞貼壁后，可于四周的壁測(cè)加入些許全培。（5） 標(biāo)記六孔板，放入孵箱中。細(xì)胞復(fù)蘇：方法一：從液氮中取出的冷凍管，迅速投入37-38C水浴中充分搖動(dòng)，使其快速融化（1左右）一一復(fù)蘇細(xì)胞直接加全培，直接培養(yǎng)（24h內(nèi)換液）方法二：從液氮中取出的冷凍管，迅速投入37-38C水浴中充分搖動(dòng)，使其快速融化（1左右）一一離心——去上清，加入全培，混勻，接種培養(yǎng)方法三：從液氮中取出的冷凍管，迅速投入37-38C水浴中充分搖動(dòng)，使其快速融化（1左右） 加4倍全培 離心（低速離心：300rpm離心5min;500rpm離心3min），去上清，加全培培養(yǎng)細(xì)胞離心，一半選用800-1000rpm，5-10分鐘消毒方法（5種）：1、高壓蒸汽消毒（玻璃器皿、金屬器材等物品消毒）2、紫外線消毒適用于無菌室及操作臺(tái)等消毒3、 濾過消毒不可加熱的液體通過0.22um濾膜過濾消毒4、 化學(xué)消毒酒精、新潔爾滅等適用于操作臺(tái)面和手等消毒，無菌室常用過氧乙酸消毒5、 火焰消毒器材使用面常用火焰消毒。吸管，瓶口和瓶塞消毒吉姆薩染色：爬片上的細(xì)胞常用甲醇冰醋酸固定后，吉姆薩染色（Giemsa）觀察。甲醇冰醋酸固定液：3份甲醇和1份冰醋酸混合，臨用前配制。1、 吸去原培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗玻璃片4遍；2、 標(biāo)本未完全干燥時(shí)，用甲醇冰醋酸固定液固定10min，中間換一次固定液；3、 固定后玻片未完全干燥時(shí)，加Giemsa染液15min；4、 吸去染色液，流水沖洗5min；5、 玻片