髓鞘相關糖蛋白的功能研究進展

神經系統(tǒng)通過髓內鞘的電隔離作用，以快速釋放神經脈沖。髓鞘的形成步驟煩瑣,需要軸突和髓鞘形成細胞——少突膠質細胞(中樞神經系統(tǒng),CNS)和施萬細胞(外周神經系統(tǒng),PNS)之間復雜的相互作用。目前得到證實的一種能介導神經元和神經膠質相互作用,參與形成致密髓鞘的分子就是髓鞘相關糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)。一、細胞外結構域與小體胞漿的聯(lián)合MAG是CNS和PNS中的一種髓鞘成分,分別占CNS和PNS髓鞘蛋白的1%和0.1%。它是一種跨膜糖蛋白,分子量約為100kD。MAG是免疫球蛋白超家族成員之一,該家族的眾多成員都能促進CNS或PNS的神經元突起生長。MAG又稱siglec-4a,siglec是指免疫球蛋白超家族中唾液酸結合蛋白中的一個亞類,它們帶有一個特征性的細胞外結構域,即氨基末端的V型免疫球蛋白(Ig)結構域和緊鄰的C2型Ig結構域,該類分子大多在免疫系統(tǒng)或神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。MAG轉錄時經不同剪接可產生67kD(S型)和72kD(L型)兩個異構體,二者胞外區(qū)和跨膜區(qū)相同,但胞漿區(qū)的長度不同。嚙齒類動物中L-MAG的表達峰值出現(xiàn)在發(fā)育早期,然后逐漸減少,主要富含于發(fā)育過程中的CNS,而S-MAG則是成年CNS和PNS中MAG的主要異構體形式,此時在PNS中L-MAG已基本消失。同時研究還發(fā)現(xiàn)只有L-MAG能激活胞漿的非受體酪氨酸激酶Fyn,而這正是神經系統(tǒng)髓鞘化信號轉導中的關鍵一步。因此推測L-MAG特有的胞漿部分對于CNS中髓鞘的形成至關重要,而S-MAG則主要用來維持PNS髓鞘的完整性。免疫組化研究結果表明,MAG定位于少突細胞和施萬細胞的表面,在軸突形成髓鞘的起始階段就可檢測到。在髓鞘化的軸突中,它定位于髓鞘膜的最里層,直接和軸突相接觸。MAG在髓鞘和軸突界面的特殊定位以及它在發(fā)育中的早期表達,提示該分子可能介導了軸突與膠質細胞間的早期相互作用,參與髓鞘化的啟動及髓鞘化軸突與膠質突起之間穩(wěn)定連接的維持。二mag和神經系統(tǒng)髓鞘形成和維護(一)背根神經節(jié)系統(tǒng)mag的表達體外實驗證實MAG介導了神經細胞與形成髓鞘的膠質細胞間的相互作用。人為降低施萬細胞中MAG的表達,則共培養(yǎng)的背根神經節(jié)(DRG)的髓鞘化受損;而上調其表達,DRG的髓鞘化啟動則加速。同時MAG還能增強少突細胞的存活,促進其與神經細胞間的粘著及髓鞘膜的形成,而對少突前體細胞分化成熟的比例則影響不大。(二)評分小鼠視網膜電泳分析MAG是髓鞘化過程中最早表達的蛋白之一,根據(jù)其細胞定位推測它可能參與髓鞘化的啟動,而對MAG缺陷鼠的髓鞘形成及形態(tài)的觀察進一步證實了這種推測。如年幼的MAG缺陷鼠,其視神經的致密髓鞘形成明顯延遲,與同齡野生鼠相比,其視網膜神經節(jié)細胞被致密髓鞘包繞的密度減少了50%;而成年缺陷鼠則呈現(xiàn)明顯低髓鞘化,其視神經中帶有眾多無髓鞘和長度較短的軸突;但該鼠外周神經的髓鞘化速度卻與野生鼠相似,故推測MAG參與了CNS而不是PNS的髓鞘化啟動。(三)成年以及老年mag缺陷鼠的超微結構改變電鏡結果顯示:MAG缺陷鼠中,致密髓鞘的超微結構不受影響,如在CNS或PNS的軸突旁區(qū),即分隔髓鞘和軸突的狹窄間隙,其構成基本正常,但某些髓鞘化的軸突有擴大的軸突旁間隙,其CNS髓鞘的軸突旁有異常細胞漿環(huán)的形成。而在成年以及老年MAG缺陷鼠中則發(fā)現(xiàn)PNS的髓鞘有明顯退行性改變,出現(xiàn)所謂的“洋蔥”細胞,即大的軸突周圍包繞著一圈小細胞,這是未成熟的施萬細胞的一種表現(xiàn)型,它們對軸突產生機械壓迫作用,干擾了軸突的運輸,最終導致軸突的退化。同時MAG對于髓鞘化軸突的管徑有正向調節(jié)作用,缺陷鼠的PNS中被髓鞘包繞的軸突管徑明顯減小,這可能與神經微絲間距減小及神經微絲磷酸化有關,提示髓鞘基因的突變可能會導致神經細胞繼發(fā)有害的改變。此外,成年MAG缺陷鼠的超微結構還發(fā)現(xiàn)少突細胞的突起遠端明顯營養(yǎng)不良,而近端突起及胞體的形態(tài)則保持完整。這種少突細胞的病變常見于包括多發(fā)性硬化癥在內的毒性或免疫介導的脫髓鞘疾病,其發(fā)病的分子機制以及同MAG基因缺陷之間的聯(lián)系尚不清楚。(四)mag/fyn的信號轉導通路動非受體型酪氨酸激酶Fyn是Src家族中的一員,它是MAG的下游信號分子,在髓鞘化啟動中發(fā)揮關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)成年Fyn缺陷鼠的CNS中出現(xiàn)明顯的低髓鞘化,其視神經中有大量未髓鞘化的小的視神經節(jié)細胞軸突,而CNS的低髓鞘化比MAG缺陷鼠還嚴重。這表明在CNS髓鞘化的啟動中,MAG/Fyn的信號轉導通路意義重大。同時該通路又是復雜的,二者都可能通過其它替代通路啟動髓鞘化,因此,在MAG/Fyn雙重突變鼠的神經系統(tǒng)中,低髓鞘化現(xiàn)象要比兩者的單獨突變體都嚴重。(五)mag的功能如上所述,MAG參與髓鞘化的啟動及完整髓鞘的維持,但觀察發(fā)現(xiàn)MAG缺陷鼠的功能障礙并不突出,其CNS中不少髓鞘的形態(tài)都是完整的,PNS的髓鞘形成也是正常的。這表明MAG并不是髓鞘化中唯一必需的分子,在缺陷體中還存在功能相似的其他分子,它們可以在一定程度上彌補MAG的缺陷,如神經粘附分子NCAM和L1等。換句話說,當MAG存在時它可啟動髓鞘化,當它缺少時,其他分子可替代MAG的功能。轉基因鼠為MAG在髓鞘形成及其維持中所起的作用提供了大量證據(jù),結合體外的細胞實驗結果,研究者推測,MAG可能充當一種受體,它將信號轉入形成髓鞘的膠質細胞,并促進其與軸突的相互作用,完成髓鞘化的啟動和髓鞘的長期維持。此外,MAG還有一個重要作用,即限制軸突的再生。三、mag和神經系統(tǒng)的軸突生長(一)mag的體內功能Shwab等(1993)最早發(fā)現(xiàn)在CNS中有潛在的生長抑制活動,并指出這種抑制與髓鞘有關,而MAG即是第一個被鑒定出的具有軸突再生抑制作用的髓鞘蛋白。通過DEAE柱層析法,從CNS髓鞘中分離得到的可溶性髓鞘蛋白——MAG可以明顯抑制突起的生長,引起生長錐的塌陷,抑制包括神經節(jié)細胞在內的多種神經元突起的生長;通過免疫耗竭法除去MAG后,可明顯減少髓鞘對軸突生長的抑制作用。但體內功能研究發(fā)現(xiàn),MAG缺陷鼠中CNS髓鞘的抑制活動并沒有顯著減少,CNS損傷后其軸突再生只輕微改善或根本沒有變化,這可能源于其他抑制分子的代償。Wong等在視神經受損后用激光急性選擇性地滅活MAG分子,發(fā)現(xiàn)有大量的視網膜軸突再生,并通過了含有CNS髓鞘的損傷部位,因此推斷MAG是髓鞘來源的神經抑制分子的主要成分。(二)drg神經元對mag的表達在MAG之后又陸續(xù)鑒定出Nogo和OMGP兩種髓鞘來源的生長抑制蛋白,相比之下,MAG受關注的程度遠不如Nogo,其關鍵在于研究人員對MAG的生長抑制活動存在爭議。先前報道MAG是有利于軸突生長的細胞粘附分子(Johnson等.1989),這與后來發(fā)現(xiàn)的抑制作用相矛盾。目前已弄清楚,此源于MAG的雙功能性,以及不同發(fā)育階段的神經元對MAG的反應性不同。據(jù)報道,出生4天以上的DRG神經元與表達MAG的細胞共培養(yǎng)時,突起延長減少約50%,而與小于4天的神經元共培養(yǎng)時反而促進突起的生長,這說明在胚胎發(fā)育的早期階段,雖然MAG和它的受體都已存在,但不阻礙軸突生長,因為神經元只有在發(fā)育的較晚階段才對它敏感,此時往往伴有神經元內源性cAMP水平的降低。人為增加成年神經元中cAMP水平可以克服MAG對軸突生長的抑制作用,將其與表達MAG的細胞共培養(yǎng)時,其軸突反被誘導生長(Vinson等.1998)。(三)抗fu-pag-g1a、gt1b以及對ngr1a的抑制劑MAG的抑制功能被證明后,其受體的鑒定同樣一波三折。MAG是siglec的成員,可以和唾液酸結合。研究發(fā)現(xiàn)用神經氨酸酶去除神經元表面的唾液酸可阻斷MAG對神經元突起生長的抑制作用,并證明帶有唾液酸的神經節(jié)苷酯GD1a和GT1b作為神經元的受體介導了MAG的抑制作用,而可溶性的GD1a、GT1b以及針對GD1a的抗體可以明顯減少MAG所介導的神經元生長的抑制作用(Vyas等.2002)。然而令人吃驚的是,后來發(fā)現(xiàn)MAG可以特異地、并以高親和力與Nogo的受體NgR結合,通過三種髓鞘抑制分子共同的信號轉導途徑,引發(fā)對神經元突起生長的抑制。NgR是富含亮氨酸重復序列(LRR)的膜蛋白,通過GPI固定于漿膜的外層,一旦將GPI連接蛋白從軸突上剪切去除,就可以保護生長錐免于MAG誘導的塌陷。而抗NgR抗體和可溶性的NgR都能阻止MAG對突起生長的抑制,甚至原本對MAG抵制的胚胎神經元,在表達NgR后也會對MAG的抑制作用敏感,而最近證實是NgR家族中的NgR2選擇性介導了MAG的抑制效應。由于NgR介導了三種髓鞘蛋白的抑制作用,因而成為CNS受損后一種很有希望的促進再生的治療靶點。(四)信號轉導途徑隨著研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)神經營養(yǎng)因子受體p75NTR在轉導MAG的抑制效應中起到共受體的作用,它與NgR、GT1b等一起構成神經元細胞膜表面的脂質閥受體復合物,共同參與MAG所介導的下游抑制信號的傳遞(Vinson等.2003),并證實p75NTR缺陷鼠的神經元對MAG的抑制不敏感,但也發(fā)現(xiàn)抑制p75NTR并不能促進受損脊髓神經元的再生,故推測它不是髓鞘抑制中的關鍵成分。最近Domeniconi等發(fā)現(xiàn)MAG通過所謂的RIP(受控的膜內蛋白水解作用),先后經α和γ-分泌酶兩次對p75NTR進行剪切,使之釋放出25kD的胞內區(qū)(ICD),后者正是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必需的,由此啟動下游信號途徑來抑制軸突的生長。因此阻斷該分泌酶的活性有可能阻斷NgR受體復合物與MAG結合所導致的軸突生長抑制,為CNS損傷后的治療性干預提供了另一有效靶點。近年來,研究還發(fā)現(xiàn)神經元內Rho失活或cAMP水平升高,MAG介導的抑制作用會被阻斷,因此認為Rho和cAMP參與的信號轉導途徑也是MAG發(fā)揮抑制作用所必需的,二者的作用與MAG介導的抑制效應相一致。推測可能是因為胞內的cAMP升高激活了蛋白激酶A,進而使Rho去磷酸化而失活,阻斷了Rho介導的生長錐的塌陷,從而阻斷了MAG的抑制作用。由于Rho是多種抑制分子和受體介導抑制作用的匯聚途徑,因而也成為CNS損傷后軸突再生和功能康復的重要藥物和治療靶點。MAG作為一種重要的髓鞘來源的神經生長抑制分子,在中樞和外周髓鞘中都有表達,但研究人員很早就發(fā)現(xiàn)中樞神經受損后不能再生,而外周神經損傷后能夠再生,那么MAG對外周神經再生難道沒有抑制作用嗎?根據(jù)現(xiàn)有的研究結果,目前可能的解釋是:首先,MAG在CNS中的含量是PNS的10倍;其次,中樞和外周神經元對MAG的反應可能存在差異;再者,外周神經損傷后髓鞘碎片能快速有效清除,致使MAG的抑制作用來不及發(fā)揮,而中樞神經損傷后髓鞘碎片的清除卻極其緩慢;此外,二者損傷后局部微環(huán)境的介質變化不盡相同,在外周可能有些介質中