實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)分子量的測定——凝膠層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握凝膠層析的基本原理。2.學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)技能。二、實(shí)驗(yàn)原理凝膠層析法也稱分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。該法設(shè)備簡單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高。凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當(dāng)含有分子大小不一的蛋白質(zhì)混合物樣品加到用此類凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時(shí)，這些物質(zhì)即隨洗脫液的流動(dòng)而發(fā)生移動(dòng)。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速率快，先被洗出層析柱；而小分子物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來，故流程長，移動(dòng)速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質(zhì)，則居二者之間從柱中流出?？傊鞣N不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子，最終由于它們被排阻和擴(kuò)散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過的路程和時(shí)間也不同，從而彼此可以分離開來。將凝膠裝在柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt表示。實(shí)質(zhì)上Vt是由Vi與Vg三部分組成，Vo稱為“孔隙體積”或“外水體積”，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中柱內(nèi)流動(dòng)相的體積；Vi為內(nèi)體積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積。Vg為凝膠本身的體積。洗脫體積(Ve)與Vo與Vi之間的關(guān)系可用下式表示：Ve二Vo+KdVi式中Ve為洗脫體積，自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時(shí)所流出的體積；Kd為樣品組分在二相間的分配系數(shù)，也可以說Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部與外部的分配系數(shù)。它只與被分離的物質(zhì)分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的長度粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對(duì)每一物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理?xiàng)l件無關(guān)。Kd可通過實(shí)驗(yàn)求得，上式可以改寫為:Kd=(Ve-Vo)/Vi上式中Ve為實(shí)際測得的洗脫體積；Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好是有顏色以便于觀察，如血紅蛋白，印度黑墨水，分子量約200萬的藍(lán)色葡聚糖-2000等）通過實(shí)際測量求得；Vi可由gXWr求得（g為干膠重量，單位為克；Wr為凝膠的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，對(duì)一層析柱膠床來說，只要通過實(shí)際實(shí)驗(yàn)得知某一物質(zhì)的洗脫體積就可算出它的Kd值。如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時(shí)沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，在洗脫時(shí)峰的位置和該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有直接的定量的關(guān)系。在一根凝膠柱中，凝膠顆粒間空隙所含水相體積為外水體積Vo,不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為時(shí)Vo,出現(xiàn)洗脫峰。凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積為內(nèi)水體積Vi,能全部滲入凝膠的那些小分子,當(dāng)洗脫體積為Vo+Vi時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。Ve與分子量的關(guān)系：對(duì)同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關(guān)，流過凝膠柱時(shí)，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關(guān)系可用下式表示：Ve=K1-K2logM，式中M為相對(duì)分子質(zhì)量，K1和K2為常數(shù),Ve也可用Ve-Vo。葡聚糖凝膠有不同的型號(hào)，用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的物質(zhì)。例如SephardexG-75的分級(jí)范圍是3000-80000的球形分子。在本實(shí)驗(yàn)中用于分離藍(lán)色葡聚糖和牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC。三、 儀器和試劑儀器:層析柱核酸蛋白檢測器（或紫外分光光度計(jì)）、自動(dòng)部分收集器、刻度管試劑:藍(lán)色葡聚糖2000、SephardexG-75、洗脫液：0.2mol/LTris-HCL-KCL,PH7.5待測樣品:藍(lán)色葡聚糖、牛血清蛋白、胃蛋白酶、CytC四、 實(shí)驗(yàn)步驟1．凝膠溶脹凝膠顆粒要求大小比較均勻，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。取葡聚糖SephardexG-75干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過程中注意不要過分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。2．裝柱與平衡裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。裝柱要求連續(xù)、均勻、無氣泡、無“紋路”。將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。3．上樣與洗脫樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1?2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將lml樣品慢慢地加至柱床表面，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量（約1ml）洗脫液沖洗管壁2次。最后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3?5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒流泵，調(diào)好流速，以每管3ml/10min流速開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%；制備用量為柱床容積的20%~30%。4．收集與鑒定用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每分鐘十五到二十滴左右，收集三分鐘，紫外檢測儀280nm波長處檢測，最高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。5．凝膠柱的處理凝膠用過后，反復(fù)用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長期用干燥狀態(tài)保存。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ve(ml)OD值Ve(ml)OD值Ve(ml)0D值Ve(ml)0D11Ve(ml)0D值8.4038.80.27262.20.09185.60.0951090.14418041.40.34364.80.09888.20.083111.60.13720.60440.35867.40.10590.80.086114.20.11823.20.01446.60.362700.10893.40.082116.80.10225.80.02549.20.31572.60.095960.093119.40.08328.40.03751.80.13175.20.10798.60.1041220.035310.0454.40.08777.80.12101.20.12733.60.047570.07980.40.122103.80.15136.20.15559.60.08830.11106.40.164做出洗脫曲線：具體標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：20(TUI)ajh20(TUI)ajh六、注意事項(xiàng)在裝柱過程中是需要注意的有以下要求：【1】垂直放置【2】放置產(chǎn)生氣泡【3】放置柱分層。柱上表面要平，平衡柱時(shí)間要長一些，讓凝膠充分沉積為均一的柱床。加樣時(shí)，【1】加樣前打開出口，使展開劑流出，至正好露出凝膠上平面時(shí)，立即關(guān)閉出口【2】加樣時(shí)，用滴管緩緩沿柱內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)加入柱子?！?】打開柱子得出口，使待分離的樣品進(jìn)入柱子。加樣完成后，進(jìn)行洗脫。七、討論：1.從洗脫曲線上可以看出，出現(xiàn)了四個(gè)較明顯的峰值(實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想)：0D:0.362(Ve=46.6ml),0.108(Ve=70ml),0.122(Ve=80.