9/24/2023中藥鑒定學(xué)專(zhuān)論丹參分子生藥研究9/24/2023一、丹參的傳統(tǒng)鑒別方法與分子生藥鑒別二、丹參分子基因組的分析及構(gòu)建三、不同產(chǎn)地丹參分子生藥基因組的分析四、高質(zhì)量的丹參葉片DNA的提取方法研究9/24/2023第一局部：丹參的傳統(tǒng)鑒別方法與分子生藥鑒別。9/24/20231丹參形態(tài)學(xué)鑒別植物學(xué)特性鑒別傳統(tǒng)方法大多根據(jù)丹參的形態(tài)方面對(duì)藥材的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒別。丹參為多年生草本,根磚紅色,莖高40~80cm,多分枝,被長(zhǎng)柔毛。葉常為奇數(shù)羽狀復(fù)葉。葉柄長(zhǎng)1~7cm,小葉3~7,頂端小葉較大。小葉卵形或橢圓狀卵形。長(zhǎng)1.5~8cm,寬0.8~5cm,先端鈍,邊緣具圓鋸齒,兩面被柔毛,下面較密,花序頂生或腋生輪傘花序有花6至多花,組成假總狀花序,密被腺毛及長(zhǎng)柔毛;小苞片披針形;花萼鐘狀,長(zhǎng)1~1.3cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠藍(lán)紫色,二唇形,長(zhǎng)2~2.7cm,花冠筒外伸,彎曲,上長(zhǎng)達(dá)2cm,筒內(nèi)有毛環(huán);雄蕊2,藥隔長(zhǎng),花絲短,上臂藥室發(fā)育,2下臂的藥室不育且聯(lián)合;小堅(jiān)果4,橢圓形,花期5~8月,果期8~9月。9/24/2023丹參形態(tài)9/24/2023丹參藥材根部性狀丹參藥材根部性狀鑒別丹參及其親緣種類(lèi)的藥用植物甚多,以根部特征區(qū)別各類(lèi)丹參也是沿用很久的經(jīng)典方法。丹參根的特征為:丹參多為帶根莖的根,根莖粗短,有莖基剩余,下著生多數(shù)細(xì)長(zhǎng)的根。根呈圓柱形,稍彎曲,外表呈磚紅色,粗糙,具多數(shù)縱溝或皺紋,有須根痕,外部栓皮常鱗片狀剝落,皮層有時(shí)開(kāi)裂,長(zhǎng)8~22cm,直徑5~12mm,質(zhì)堅(jiān)脆,易折斷,斷面不平,疏松有裂隙,皮部棕渴色或磚紅色,韌皮部狹。形成層明顯,淡棕色,木質(zhì)部導(dǎo)管束灰黃色或黃白色,放射狀排列。氣微,味微苦、澀,以條粗壯、色紫紅者為佳。9/24/2023丹參藥材根部形態(tài)9/24/2023水試鑒別法：用水浸泡丹參根的方法對(duì)丹參進(jìn)行鑒別,正品丹參根浸泡后的溶液無(wú)色,藥材稍膨脹,顏色稍微變淺。偽品丹參溶液顯紅色藥材變?yōu)榈t色。水浸后續(xù)斷會(huì)被染成紅色,粉末中有草酸鈣簇晶;丹參水浸不染成紅色,粉末中無(wú)草酸鈣簇晶,但有石細(xì)胞及紅棕色物為丹參。從而將兩者進(jìn)行區(qū)分。9/24/2023顯微結(jié)構(gòu)鑒別根的橫切面顯微結(jié)構(gòu)鑒別根粉末的顯微結(jié)構(gòu)鑒別花粉形態(tài)學(xué)特征對(duì)丹參及同屬藥用植物的鑒別9/24/2023根的橫切面顯微結(jié)構(gòu)鑒別根據(jù)丹參橫切面顯微結(jié)構(gòu)特征與紫丹參進(jìn)行區(qū)分,丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)木栓層3~7列,木栓細(xì)胞長(zhǎng)方形,切向延長(zhǎng),壁非木化或微木化;外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)落皮層。皮層窄,纖維單個(gè)散在或2~6個(gè)成群,孔溝放射狀,層紋細(xì)密。韌皮部較窄,由篩管群和薄壁細(xì)胞組成。形成層明顯成環(huán)。木質(zhì)部寬廣,4~12mm呈放射狀排列。有些相鄰的束在內(nèi)側(cè)合并,導(dǎo)管類(lèi)圓形或多角形,有的沿徑向延長(zhǎng),直徑15~65mm,單個(gè)散在或2~12個(gè)成群,徑向排列或切向排列;木纖維興旺,多成群分布于大導(dǎo)管周?chē)?有的本質(zhì)部束內(nèi)有1~2群木化薄壁細(xì)胞;木射線寬廣,射線細(xì)胞多木質(zhì)化增厚。紫丹參根莖表皮細(xì)胞1列,內(nèi)含紫紅色物質(zhì);皮質(zhì)薄壁細(xì)胞有的具紋孔;髓部薄壁細(xì)胞壁呈連珠狀增厚或稍增厚,具紋孔。根本質(zhì)部束常較小,導(dǎo)管也少。9/24/2023根粉末的顯微結(jié)構(gòu)鑒別丹參粉末呈紅棕色。木栓細(xì)胞黃棕色,外表觀呈類(lèi)方形或多角形,壁稍厚,胞腔內(nèi)常含紅棕色色素,色素溶解后,斷面觀細(xì)胞類(lèi)長(zhǎng)方形,排列較整齊。木纖維多成束,長(zhǎng)梭形,紋孔斜裂縫狀或十字狀,孔溝稀。導(dǎo)管主要為網(wǎng)紋和具斜紋孔導(dǎo)管。石細(xì)胞呈類(lèi)圓形、類(lèi)三角形、類(lèi)梭形、類(lèi)長(zhǎng)方形或不規(guī)那么形,也有延長(zhǎng)呈纖維狀,有的胞腔內(nèi)含棕色。9/24/2023花粉形態(tài)學(xué)特征對(duì)丹參及同屬藥用植物的鑒別一定的植物具有一定形態(tài)的花粉,因此花粉形態(tài)研究也是植物分類(lèi)鑒別的依據(jù)之一。丹參的花粉以外壁較薄、紋飾網(wǎng)眼較淺、網(wǎng)脊較粗、溝較寬、溝底具顆粒而區(qū)別于其他種。9/24/2023理化學(xué)方法鑒別根據(jù)丹參所含的化學(xué)成分進(jìn)行鑒別經(jīng)過(guò)大量分析研究說(shuō)明丹參所含化學(xué)成分中二萜醌成分與系統(tǒng)發(fā)育有密切關(guān)系,二萜醌類(lèi)化合物組成的不同可以作為種類(lèi)鑒別的依據(jù),根據(jù)二萜醌成分含量的多少對(duì)丹參組作丹參的藥用植物的親緣關(guān)系進(jìn)行劃分。9/24/2023薄層色譜鑒別采用薄層色譜定性鑒別的方法比較后指出在同一展開(kāi)系統(tǒng)的條件下,無(wú)論是野生還是栽培品種,丹參的一些主要成分相同,以此可以作為識(shí)別丹參藥材真?zhèn)蔚膮⒖家罁?jù)。9/24/2023紫外吸收光譜鑒別丹參在253,277nm兩處有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248,218,203nm4處有吸收特征峰。作丹參使用的藥材紫外吸收光譜的范圍不同,據(jù)此可以對(duì)兩者進(jìn)行鑒別。丹參粉末處理后置紫外燈(365nm)下現(xiàn)察顯亮藍(lán)灰色熒光。9/24/2023指紋圖譜鑒別(HPLC法)具有色譜穩(wěn)定性好、柱效高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn),是中藥指紋圖譜研究中常用的手段。對(duì)丹參等幾種中藥指紋圖譜與代謝指紋圖譜研究的結(jié)果,指出不同產(chǎn)地的藥材在指紋圖譜上存在較大差異。9/24/2023分子生物學(xué)鑒別方法1RAPD鑒別法：隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于物種鑒別。2DNA遺傳標(biāo)記技術(shù)隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的日趨成熟,從遺傳DNA分子水平檢測(cè)生物遺傳多樣性并進(jìn)行分類(lèi)與鑒定已成為可能。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),且不受生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位、環(huán)境條件的影響,已在中藥鑒定學(xué)研究中展示了良好的應(yīng)用前景,并保持強(qiáng)勁的開(kāi)展勢(shì)。9/24/2023第二局部丹參分子基因組的分析及構(gòu)建9/24/20231丹參主要居群DNA指紋圖譜的建立2丹參EST序列中SSR信息的分析及建立9/24/2023丹參主要居群DNA指紋圖譜的建立基因組DNA的提取編號(hào)名稱(chēng)來(lái)源花顏色Al大葉丹參四川中江紫色A2商洛丹參陜西商洛紫色A3首縣紫花丹參山東芭縣紫色A4四倍體丹參中國(guó)藥科大學(xué)紫色A5芭縣白花丹參山東芭縣紫色A6北京丹參中國(guó)中醫(yī)藥研究院紫色A7毫州丹參安徽亳州紫色A8丙城丹參山西茵城紫色A9江蘇丹參江蘇射陽(yáng)紫色A10小葉丹參四川中江紫色A11安國(guó)丹參河北安國(guó)紫色A12甘西鼠尾草甘肅紫色A13一串紅陜西省雜交油菜研究中心紅色A14油菜陜西省雜交油菜研究中心黃色A15小麥陜西省雜交油菜研究中心注:Al一Al，為各居群編號(hào)，以下同。9/24/2023RAPD一PCR擴(kuò)增反響體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化別設(shè)計(jì)M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度等單因子試驗(yàn)，同時(shí)保持?jǐn)U增體系的其它成分濃度及擴(kuò)增程序其它環(huán)節(jié)不變，以?xún)?yōu)化、確證適宜的M擴(kuò)+、Taq酶、模板DNA的濃度及退火溫度。9/24/2023鑒別丹參與其近緣和遠(yuǎn)緣植物的特征引物及其DNA指紋圖譜引物s2035、s222擴(kuò)增結(jié)果不僅穩(wěn)定、條帶明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指紋圖譜丹參主產(chǎn)區(qū)的n個(gè)居群丹參的PCR擴(kuò)增帶型幾乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七條共同的特異條帶，即圖6的條帶Cl、CZ、C3、C4、圖7的CS、C6、C7，各丹參居群完全相同。9/24/2023結(jié)果驗(yàn)證：結(jié)果驗(yàn)證顯示，PCR擴(kuò)增重復(fù)性較好，取樣合理，能夠代表各居群。9/24/2023丹參EST序列中SSR信息的分析及建立丹參EST序列中SSR信息的分析微衛(wèi)星〔Microsatellite〕又稱(chēng)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simplesequencerepeat)，指的是基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的根本單位重復(fù)屢次構(gòu)成的一段DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，長(zhǎng)度一般在200bp以下SsR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富，多性高，多等位基因，共顯性，重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)建立SSR標(biāo)記的序列性質(zhì)不同可分為基因組SSR〔GenomicSSR,gSSR〕和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR〔ExpressedsequencetagSSR，EST-SSR〕。EST及表達(dá)序列標(biāo)簽是通過(guò)從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的5’或3’端序列，長(zhǎng)度一般在150~500bp。9/24/2023丹參EST-SSR引物情況表引物編號(hào)重復(fù)基元GeneBankEST編號(hào)預(yù)期產(chǎn)物bp引物序列退火溫度〔℃〕SSR001

(TACA)5

CV172410

241

GAGGCTACTTCGTGGAGG

52.3GAAACTAAAGCAACAAACCC

52.1SSR002

(CA)16

CV172134

176

CCGTGGTGTTCCCTCTTT

55TGCCGATTCTAACCTGTATG

53.7SSR003

(CT)10

CV171877

137

AGAGGCTGCTGCTTCATT

52.7TCAAGTCATAGGCGTGGC

54.5SSR004

(AAC)6

CV171649

222

AGGCAGACAGACCTCATA

46.7CTTCCCACCAAATAACTC

46.8SSR005

(GTG)6

CV171565

153

CTCAGCACCTACTACCACAT

49.6CTTATCCCAACACTTCTTCT

48.5SSR006

(ATC)5

CV171563

155AAACAGAGCGACGAAGCAG

56.29/24/2023ACCACCATCACTCAAGACG56.4SSR007(CTT)11FE537066165CTCCGCTTCGCTCCTCTT57.7TGCTCGCTTCGTCGTCTT57.2SSR008(GCT)6FE536370181AGGTTACTACCGATGAAGCAG54.1AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT53.2SSR009(AAG)6FE536230145GACTTTGGATGCCTGCTC52.9GACGCCGCTACTTTCTAT50.2SSR010(TATGC)5FE536872136AATAAGGCAATACAGGGTC49.2CTTTACACGCATAACACG47.4SSR011(TC)18FE536561162AACTTGGCAATGTTCGCTAT55.2GCTTGTTCTTGACAGGCTTC54.9SSR012(TC)8tatct(AC)8FE536456161GGTCCATTCCTCTTATTTCC52.9GCCATCAAGTGGTCGTCT55.6SSR013(AGC)6FE536096162CAGTCCAACAGCCCGACCAG63.4ATCATCATCGCCAGCATCCC62.4從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載鼠尾草屬EST序列11747條，其中包括丹參EST序列10228條和Salviafruti－cosa1519條，應(yīng)用對(duì)含有SSR的序列進(jìn)行搜索。搜索參數(shù)設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账?、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重?fù)次數(shù)分別為18次、6次、5次、4次、4次、3次9/24/2023丹參的EST-SSR分布頻率與特點(diǎn)丹參EST-SSR中共包含77種重復(fù)基元。單核苷酸重復(fù)有1種A/T。二核苷酸重復(fù)也為3種，以AG/CT為主，占64.21%。三核苷酸重復(fù)為10種

丹參EST-SSR信息情況表重復(fù)類(lèi)型基元種數(shù)SSR數(shù)占全部SSR比例出現(xiàn)頻率單核苷酸重復(fù)1106953.0810.45二核苷酸重復(fù)338018.873.72三核苷酸重復(fù)1045022.344.40四核苷酸重復(fù)6150.740.15五核苷酸重復(fù)9130.650.13六核苷酸重復(fù)48874.320.85總計(jì)772021100.0019.699/24/2023丹參二、三核苷酸重復(fù)基元情況表重復(fù)類(lèi)型基元數(shù)量占該類(lèi)型比例出現(xiàn)頻率單核苷酸重復(fù)A/T

1069

100.00

10.45二核苷酸重復(fù)AC/GT

60

15.79

0.59

AG/CT

244

64.21

2.39AT/AT

76

20.00

0.74三核苷酸重復(fù)AAC/GTT

8

1.78

0.08AAG/CTT

79

17.56

0.77AAT/ATT

9

2.00

0.02ACC/GGT

14

3.11

0.03ACG/CTG

123

27.33

1.20ACT/ATG

41

9.11

0.40AGC/CGT

36

8.00

0.35AGG/CCT

25

5.56

0.24AGT/ATC

95

21.11

0.93CCG/CGG

20

4.44

0.209/24/2023第三局部不同產(chǎn)地丹參分子生藥基因組的分析9/24/2023不同產(chǎn)地丹參遺傳關(guān)系的DNA標(biāo)記分析利用RAPD與ISSR標(biāo)記對(duì)不同產(chǎn)地的野生與栽培丹參的遺傳變異進(jìn)行分析,以期為丹參藥材的引種栽培與科學(xué)選育提供科學(xué)依據(jù)。不同產(chǎn)地丹參野生與栽培藥材RAPD與ISSR標(biāo)記的遺傳變異藥材取樣個(gè)體多態(tài)條帶數(shù)多態(tài)條帶比率基因多樣性原產(chǎn)地P(%)指數(shù)(Ht)栽培藥材S-AHBZ82221.570.075安徽亳州

S-SXYC

8

21

20.59

0.0708山西運(yùn)城

S-JSBH598.820.0361江蘇濱海

S-SCZJ51312.750.0518四川中江

S-JSSY843.920.0129江蘇射陽(yáng)

S-JSRG61514.710.0474江蘇如杲物種水平408785.290.1934野生藥材S-SDYS376.860.0314

山東沂水

S-SD3113.570.0078

山東

S-SDPY21211.760.0439

山東平邑

S-SX21716.670.0675

陜西物種水平106260.780.1738總計(jì)509795.100.23899/24/2023結(jié)論：不同產(chǎn)地丹參的遺傳分化根據(jù)POPGENE計(jì)算不同產(chǎn)地丹參間Nei無(wú)偏遺傳距離與遺傳一致性見(jiàn)表3。10個(gè)產(chǎn)地的丹參間,產(chǎn)自山西運(yùn)城的丹參(S-SXYC)與來(lái)自江蘇濱海的丹參(S-JSBH)的遺傳距離最小,為0.0996;而來(lái)自山西運(yùn)城的丹參(S-SXYC)與來(lái)自山東的丹參(S-SD)的遺傳距離最大,為0.3777;遺傳一致性正好與遺傳距離相反,遺傳距離最小的兩個(gè)產(chǎn)地的丹參,遺傳一致性表現(xiàn)的最大,S-SXYC與S-JSBH之間的遺傳一致性最大,為0.9052,說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系最近。江蘇3個(gè)產(chǎn)地居群的遺傳一致性介于0.8267與0.8389之間,平均0.8339;山東3個(gè)產(chǎn)地的丹參遺傳一致性介于0.6898與0.8088之間,平均0.7597,說(shuō)明不同產(chǎn)地的丹參間存在明顯的遺傳分化。9/24/2023第四局部高質(zhì)量的丹參葉片DNA的提取方法研究9/24/2023材料和方法樣品的采集及預(yù)處2004年7月~9月份在泰山采集白花丹參的成熟葉片,涼干保存1個(gè)月。試劑和儀器1試劑CTAB(上海生工),Vc(北京鼎國(guó)),SDS(上海生工),PVP(上海生工),β-mercap-toethanol(上海生工),Taq酶(Takara),AFLPcorereagentkit(invitrogen,CatNo1084-016)。2儀器PTC-100基因擴(kuò)增儀(MJ公司),Al-legraTM64Rcentrifuge(BECKMAN)離心機(jī),DNA離心真空枯燥器(Savant),EC-600-90(E-Cappara-tuscorporation)高壓電泳儀9/24/2023方法改進(jìn)CTAB法:用常規(guī)CTAB法作為根本方法,添加一些抗氧化劑和提高CTAB的比例。處理A:提取液中加Vc干粉末30mg(1·5mg/mg葉片)。處理B(PVP預(yù)洗法):加PVP粉末(干葉量的10%),與干葉共同在液氮下研碎。參加4℃預(yù)冷的CTAB-freebuffer(0·2MTris-clpH8·0,0·05MEDTA,0·25MNaCl,內(nèi)含4%β-mercaptoethanol),冰上放置10min,7000rpm(不能太高,否那么膜破,DNA損失),4℃,離心10min,棄上清。然后加Vc干粉末(1mg/mg干葉片)于4×CTAB