生物發(fā)酵法制備放射毛霉制備殼聚糖的研究

甲殼素，也稱為三丁素和甲殼素，是一種廣泛存在于自然界的天然聚合物。它的學(xué)名為n-2-氨基-2-脫氧-d-葡萄糖，方程式為（c8h13no5）n。甲殼素是其次的自然資源。殼聚糖(Chitosan)又稱聚氨基-D-葡萄糖,是甲殼素部分脫去乙?；漠a(chǎn)物。甲殼素和殼聚糖在醫(yī)學(xué)、藥物制劑學(xué)、印染、化工、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的用途。與甲殼質(zhì)相比,殼聚糖的溶解度大為改善,因而其應(yīng)用范圍也更廣。殼聚糖的提取,目前主要是以蟹、蝦為原料,也有以蠅蛹?xì)?寬跗隴馬陸和蟬蛻為原料用化學(xué)方法提取,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)以絲狀真菌為原料提取殼聚糖的詳細(xì)報(bào)道。本研究介紹一種新的殼聚糖制備方法:以絲狀真菌發(fā)酵時(shí)形成的菌絲體為原料,利用其細(xì)胞中存在的甲殼素合成酶和甲殼素脫乙酰酶的自身催化作用,把其細(xì)胞內(nèi)容物尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡萄糖胺轉(zhuǎn)變成殼聚糖,并研究了各制備條件對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)率的影響,以期為工業(yè)生產(chǎn)提供可靠的數(shù)據(jù)。1實(shí)驗(yàn)1.1種子溶液培養(yǎng)基的制備和消毒采用本實(shí)驗(yàn)室的種子液培養(yǎng)基配方配制100mL的種子液,在0.1MPa壓力下消毒30min。1.2優(yōu)雅中的輻射細(xì)菌育種采用經(jīng)過(guò)篩選的第三代雅致放射毛霉(Accimonueorelegams)在無(wú)菌操作臺(tái)上接種,并放入恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)。1.3發(fā)酵培養(yǎng)液的配制采用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方,在250mL錐形瓶中配成若干份50mL的發(fā)酵培養(yǎng)液做批量實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵液在0.1MPa壓力下消毒30min。1.4引進(jìn)和發(fā)酵在無(wú)菌操作臺(tái)上引5mL含有雅致放射毛霉的種子液于每瓶50mL發(fā)酵培養(yǎng)液中,放入恒溫?fù)u床發(fā)酵。1.5地殼聚糖提取菌種培養(yǎng)后取菌絲充分沖洗干凈烘干稱重,先用稀堿加熱脫蛋白,再用稀酸處理提取殼聚糖,具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)。1.6產(chǎn)品的紅外譜圖定性分析產(chǎn)品殼聚糖干燥,粉碎后,通過(guò)Nicolet550型FTIR光譜儀采用KBr壓片法測(cè)得紅外光譜圖,并與從蝦殼制備的殼聚糖作對(duì)比。1.7產(chǎn)品x的衍射定性分析將干燥樣品置于日本理學(xué)D/MAX-RB型X衍射儀上記錄X衍射光譜,并與從蝦殼制備的殼聚糖作對(duì)比。2討論2.1殼聚糖的產(chǎn)率將發(fā)酵溫度分別控制在22、24、26、28、30、32、34℃,轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)45h后比較殼聚糖產(chǎn)率,結(jié)果見(jiàn)表1。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,適合于制備殼聚糖最佳溫度為28℃。2.2殼聚糖產(chǎn)率測(cè)定發(fā)酵溫度控制在28℃,搖床轉(zhuǎn)速分別取150、175、200、225、250、275、300r/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)45h后比較殼聚糖產(chǎn)率,結(jié)果見(jiàn)表2。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,轉(zhuǎn)速大于250r/min,殼聚糖產(chǎn)率趨于穩(wěn)定,故取轉(zhuǎn)速250r/min。2.3脫乙酰度最佳ph值的確定實(shí)驗(yàn)表明,在培養(yǎng)過(guò)程中,pH值對(duì)生成殼聚糖的脫乙酰度影響較大,可以通過(guò)改變pH值來(lái)獲得脫乙酰度不同的殼聚糖,經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得最佳pH值為7.4～7.6。2.4殼聚糖的產(chǎn)率發(fā)酵溫度控制在28℃,搖床轉(zhuǎn)速為250r/min,培養(yǎng)時(shí)間取35h,40h,45h,50h,60h,進(jìn)行實(shí)驗(yàn),比較殼聚糖產(chǎn)率,結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)表明適時(shí)收獲是個(gè)很關(guān)鍵的問(wèn)題,菌株在培養(yǎng)過(guò)程中,殼聚糖的產(chǎn)量和相對(duì)分子質(zhì)量都在變化。培養(yǎng)初期可以發(fā)現(xiàn)菌絲體迅速生長(zhǎng),殼聚糖的量也迅速增加。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加,逐漸達(dá)到飽和,菌絲體的量不再增加;另一方面,殼聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量隨著培養(yǎng)期的延長(zhǎng)而迅速下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)時(shí)間為45h,此時(shí)殼聚糖產(chǎn)率可達(dá)15.68%。2.5霉聚糖的穩(wěn)定性紅外譜圖比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)由蝦殼生產(chǎn)的殼聚糖的峰較多,這說(shuō)明產(chǎn)品中雜質(zhì)較多,而用雅致放射毛霉生產(chǎn)的殼聚糖的峰較少,如圖1所示,這說(shuō)明產(chǎn)品中雜質(zhì)少,很純凈。在1550～1655cm-1處的CN峰比較,蝦殼生產(chǎn)的殼聚糖脫乙酰度在60%～70%左右,而且峰是裂峰,而雅致放射毛霉生產(chǎn)的殼聚糖CN峰細(xì)長(zhǎng)而尖,這證明脫乙酰度好,在85%～90%左右。2.6蝦殼聚糖的分離和測(cè)定從X衍射譜看,蝦殼生產(chǎn)的殼聚糖與絲狀真菌生產(chǎn)的殼聚糖略有差別,但其特征峰9°、19°完全一致,這說(shuō)明從絲狀真菌中提取的物質(zhì)確系殼聚糖,且結(jié)構(gòu)與蝦殼殼聚糖相同。3殼聚糖的制備(1)用雅致放射毛霉為原料,通過(guò)發(fā)酵法制備殼聚糖是可行的。最佳條件是溫度為28℃,搖床轉(zhuǎn)速為250r/min,pH值為7.4～7.6,培養(yǎng)時(shí)間為45h,殼聚糖產(chǎn)