dna甲基化與腫瘤

d-甲基化合物是表面遺傳（epigen）的形狀。在二甲基化合物轉(zhuǎn)移酶的作用下，s-腺苷酸提供的甲基將第五亞甲基碳原酸轉(zhuǎn)化為亞甲基碳原酸，并將第五亞甲基酯轉(zhuǎn)化為亞甲基酯。在哺乳動物基因組中,DNA甲基化的主要位點是CpG二核苷酸,它在基因組中呈不均勻分布。在某些區(qū)域CpG序列的密度比平均密度高10~20倍,G+C含量大于50%,其長度大于200個堿基,這些區(qū)域命名為CpG島。大約50%的人類基因中含有CpG島,常位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動子,這些基因為管家基因或組織特異表達基因。啟動子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài),基因能正常表達,當其發(fā)生甲基化時,影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控,使基因表達發(fā)生沉寂。與CpG島相反的是,基因組中散在分布的CpG二核苷酸通常處于甲基化狀態(tài)。DNA甲基化在維持染色體結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生中起重要作用。DNA甲基化屬于表觀遺傳學范疇,表觀遺傳學是一門新興學科,它研究非DNA序列變化引起的,在細胞分裂中可遺傳的基因修飾作用,該種修飾影響DNA和其他分子的相互作用,并通過細胞分裂和增殖遺傳。其分子機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和RNA干擾等,它們在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中扮有重要角色。越來越多的研究表明,DNA甲基化異常在多種腫瘤的發(fā)生中起重要作用,目前在該領(lǐng)域的研究主要集中在甲基化在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用機制、甲基化檢測對腫瘤的診斷和預后評估以及應用甲基化抑制劑治療腫瘤等方面。1影響dnsa的因素1.1dnnt3a和dnnt3b的基因序列及基因型示象站檢測DNA甲基化是由DNMT催化完成的,哺乳動物細胞中已知有活性的DNMT有3種,它們是DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。DNMT1的主要功能是作為DNA復制復合物(DNAsynthesome)中的組分,催化子鏈DNA半甲基化位點甲基化,維持復制過程中甲基化位點的遺傳穩(wěn)定性;DNMT3a和DNMT3b主要催化從頭甲基化,以非甲基化的DNA為模板,催化新的甲基化位點形成,在胚胎發(fā)育中起重要作用。利用人的結(jié)直腸癌細胞系進行研究表明,DNMT1和DNMT3b共同維持HCT116細胞的甲基化狀態(tài),單獨破壞兩種酶活性對基因的甲基化狀態(tài)影響較小,但同時破壞兩基因的功能會使整個基因組的甲基化水平下降95%以上,從而導致沉寂的抑癌基因P16重新表達,重復序列的去甲基化,類胰島素生長因子2(IGF2)基因的印記丟失。這一顯著改變證明在人的腫瘤細胞中DNMT1和DNMT3b共同維持DNA的甲基化和基因沉寂。1.2對dna甲基化的調(diào)控組蛋白的甲基化可能對指導DNA的甲基化有一定意義,有人用名為脈孢菌(Neurosporacrassa)的真菌進行研究,當破壞編碼組蛋白H3尾部的第9位賴氨酸(H3K9)甲基轉(zhuǎn)移酶的基因dim-5時,組蛋白H3K9不能發(fā)生甲基化,導致基因組胞嘧啶甲基化的丟失,由此推斷該菌中組蛋白H3K9的甲基化可以指導DNA甲基化。FuksF等發(fā)現(xiàn),在哺乳動物細胞中,甲基化的CpG結(jié)合蛋白MeCP2不僅能促進組蛋白去乙?；?抑制基因沉寂;同時它還是DNA甲基化和組蛋白甲基化的橋梁。MeCP2可結(jié)合于H19基因啟動子區(qū)甲基化的DNA,并影響組蛋白H3甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,促使組蛋白H3的賴氨酸甲基化,后者與DNA甲基化一起對H19基因的表達起抑制作用。1.3無甲基供體的igf2近年研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳與飲食、藥物等外界環(huán)境因素直接相關(guān)。這些環(huán)境因素作用于人體,能通過表觀遺傳改變使染色質(zhì)構(gòu)型重塑,并且這種改變是可逆的。當環(huán)境因素產(chǎn)生不利于機體的表觀遺傳變化時,會促進腫瘤等疾病的發(fā)生。WaterlandRA等發(fā)現(xiàn)斷奶后的飲食影響IGF2基因的甲基化狀態(tài),當飲食中缺乏葉酸、維生素B12等甲基供體時,可導致成年后IGF2的印記丟失。葉酸是水溶性B族維生素的一種,在一碳單位代謝中,它是合成5,10-四氫葉酸的前體物質(zhì),最終生成S-腺苷蛋氨酸(SAM),而后者是胞嘧啶甲基化主要的甲基供體,有人認為,當葉酸攝入不足時直接影響SAM的生成,導致DNA低甲基化。當鼠的飲食中嚴重缺乏甲基供體時,會出現(xiàn)DNA低甲基化,這可能與一些重要的癌基因,如c-myc、c-fos、c-Ha-ras表達增加有關(guān),從而促進腫瘤的產(chǎn)生。荷蘭的一項隊列研究表明,葉酸攝入過低可導致甲基化狀態(tài)紊亂,這種變化可被過量飲酒所加劇。用甲基化特異性PCR的方法研究了122例散發(fā)性結(jié)直腸癌一些基因的啟動子,這些基因有APC-1A、P14、P16、hMLH1、O6-MGMT、RASSF1A,在低葉酸、高酒精攝入組至少有一個基因啟動子甲基化的發(fā)生頻率高于高葉酸、低酒精攝入組。研究表明葉酸、酒精的攝入量與散發(fā)性結(jié)直腸癌中抑癌基因或DNA修復基因的啟動子高甲基化相關(guān)。1.4通過誘導phb基因甲基化發(fā)生在哺乳動物和植物細胞中,雙鏈RNAs(包括siRNA和miRNA)可以誘導產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉寂。最新研究表明,siRNA可以作用于特定基因的啟動子區(qū),誘導啟動子DNA發(fā)生甲基化,抑制基因轉(zhuǎn)錄,從而導致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉寂。在人類細胞中,特異的siRNA可以結(jié)合于E-cadherin啟動子區(qū)的CpG島,誘導DNA甲基化和組蛋白H3K9甲基化。當破壞細胞中兩種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3b發(fā)揮功能時,siRNA的結(jié)合不能使DNA甲基化,這表明siRNA通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導DNA甲基化發(fā)生。BaoN等通過對植物的研究提出了miRNA誘導PHB基因甲基化發(fā)生的模型:定位于胞漿中的miRNA可以重新進入胞核,與正在合成的PHBmRNA結(jié)合,而這時的mRNA為不成熟的mRNA,還沒有從染色體DNA中釋放出來,導致結(jié)合位點處形成染色質(zhì)塑型復合體(chromatin-modifyingcomplex),miRNA可能作為該復合體的一部分,直接誘導PHB基因甲基化及染色質(zhì)重塑;也可能通過修飾或切割mRNA間接地促進這一復合物的形成,從而促進DNA甲基化。但在人類細胞中RNA干擾誘導DNA甲基化的發(fā)生機制仍有待于深入研究。2cpg甲基化結(jié)合蛋白真核細胞基因轉(zhuǎn)錄是受多種因素調(diào)節(jié)的復雜過程,目前已發(fā)現(xiàn)多種基因的轉(zhuǎn)錄抑制與啟動子區(qū)CpG島高甲基化相關(guān)。位于啟動子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài),可以與轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達。此外,具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性(HistoneAcetyltransferases,HAT)的蛋白也結(jié)合于啟動子區(qū),使啟動子附近的核小體中組蛋白H3N端尾部的賴氨酸發(fā)生去乙?；?促進轉(zhuǎn)錄活化。當啟動子區(qū)CpG島發(fā)生甲基化后,轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄輔助因子及具有HAT活性的因子不能結(jié)合于此部位,代替它們的是CpG甲基化結(jié)合蛋白(methylCpG-bindingdomainproteins,MBDs)。MBDs結(jié)合于甲基化的CpG啟動子區(qū),促使組蛋白去乙?；瘡秃衔?HistoneDeacetylase,HDAC)和其他轉(zhuǎn)錄抑制因子的結(jié)合,形成核心組蛋白去乙?；瘡秃衔?作用于啟動子下游的組蛋白,使組蛋白H3、H4N端尾部的賴氨酸發(fā)生去乙?；?從而導致組蛋白上正電荷增加,與帶負電荷的DNA相互作用,使染色體結(jié)構(gòu)壓縮,進一步限制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,引起轉(zhuǎn)錄抑制。IchimuraT等最新研究報道,MBD1識別甲基化的CpG,形成MBD1-MCAF1-SETDB1復合物,MCAF1是MBD1-containingchromatin-associatedfactor1的英文縮寫,SETDB1是一種H3-K9甲基轉(zhuǎn)移酶,可催化組蛋白H3K9發(fā)生甲基化。異染色質(zhì)蛋白1(HeterochromatinProtein1,HP1)結(jié)合于甲基化的H3K9,使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)壓縮,促進異染色質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄抑制。此外,MBD1具有轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域,可以強烈抑制啟動子活性,阻止轉(zhuǎn)錄激活因子SP1結(jié)合于啟動子區(qū)的GCbox,抑制SP1介導的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化與組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑共同作用,導致轉(zhuǎn)錄抑制,其中涉及很多蛋白分子的相互作用,很多細節(jié)仍有待于深入研究。需要注意的是,以上僅探討了基因啟動子區(qū)甲基化對轉(zhuǎn)錄的抑制,而甲基化的發(fā)生遍布整個基因組,在不同區(qū)域發(fā)生甲基化,產(chǎn)生的影響是不同的。3不同基因組的cpg島以及組織特異性在人類基因組中,發(fā)生甲基化的CpG二核苷酸有兩種分布形式,一種是分布于CpG島區(qū),常存在于基因5′端的基因調(diào)控區(qū),其甲基化狀態(tài)直接影響基因表達;另一種為散在分布的CpG二核苷酸。正常細胞內(nèi),啟動子區(qū)的CpG島呈非甲基化狀態(tài),而占大部分的散在分布的CpG二核苷酸多發(fā)生甲基化。當基因組DNA的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變時,會造成機體染色體不穩(wěn)定或基因表達異常,在腫瘤的發(fā)生中起重要作用?；蚪M中絕大多數(shù)位點的甲基化狀態(tài)是恒定的,但少數(shù)位點的甲基化狀態(tài)可以發(fā)生改變,如某些組織特異基因的啟動子甲基化狀態(tài)具有組織特異性,即僅在表達的組織中呈非甲基化狀態(tài)。異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化,前者指正常組織中不發(fā)生甲基化的位點被甲基化,后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點去甲基化。3.1hmlh1啟動子高甲基化基因啟動子區(qū)的CpG島在正常狀態(tài)下一般是非甲基化的,當其發(fā)生甲基化時,常導致基因轉(zhuǎn)錄沉寂,使重要基因如抑癌基因、DNA修復基因等喪失功能,從而導致正常細胞的生長分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時修復,這與多種腫瘤形成密切相關(guān)。最近有人對人類70個腫瘤細胞系中15種基因的啟動子甲基化狀態(tài)進行系統(tǒng)研究,這70個細胞系包括12種腫瘤,分別是乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、白血病、黑素瘤、膀胱癌、頭頸部腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腎腫瘤、甲狀腺癌和淋巴瘤,15種基因為P16、P14、P15、P73、O6-MGMT、hMLH1、GSTP1、BRCA1、E-cadherin、TIMP-3、RARβ2等,證明每種腫瘤至少有一個基因的啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化,并且這些基因啟動子甲基化具有腫瘤類型的特異性,如結(jié)直腸癌細胞系中可見hMLH1、O6-MGMT的啟動子高甲基化,但在乳腺癌細胞系中僅O6-MGMT啟動子出現(xiàn)高甲基化,hMLH1從不發(fā)生甲基化;癌細胞的擴散能力與基因E-cadherin和TIMP-3有關(guān),結(jié)直腸癌細胞系中經(jīng)常出現(xiàn)TIMP-3高甲基化,而黑素瘤細胞系中經(jīng)常出現(xiàn)E-cadherin高甲基化。對西方國家51例肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)82%的癌組織出現(xiàn)抑癌基因啟動子高甲基化,最常見于SOCS-1、GSTP、APC、E-cadherin和P15基因;與肝硬化相比,SOCS-1、GSTP、P15基因更易在肝細胞癌中發(fā)生甲基化。國外研究表明,抑癌基因的異常甲基化可作為分子診斷標志物。在中國人肺癌中異常高甲基化是導致P16基因失活的主要機制,研究肺癌患者痰液標本中該基因的甲基化狀態(tài)可作為肺癌輔助診斷的方法之一。劉晉祎等用MS-AP-PCR技術(shù)在基因組范圍對中國21例肺癌腫瘤組織進行DNA高甲基化片段的篩選,分離到8個高甲基化片段,預測其中4個片段位于候選啟動子區(qū),提示可能源于新的基因。最近對140例神經(jīng)母細胞瘤的CpG島的甲基化表型研究揭示出現(xiàn)CpG島甲基化表型(CpGislandmethylationphenoltype,CIMP)的患者預后很差,這與重要的抑癌基因RASSF1A、BLU啟動子CpG島的甲基化導致基因沉寂有關(guān)。CIMP的概念是在結(jié)直腸癌研究中提出的,指多種抑癌基因的啟動子同時在同一腫瘤細胞中出現(xiàn)高甲基化,導致轉(zhuǎn)錄沉寂,功能失活。hMLH1基因是錯配修復系統(tǒng)重要的基因之一,該基因?qū)S持正?；蚪M的穩(wěn)定性起重要作用。多項研究證明,hMLH1啟動子高甲基化經(jīng)常出現(xiàn)于散發(fā)性結(jié)直腸癌及部分遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌中,且與散發(fā)性結(jié)直腸癌中出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性有關(guān)。當應用去甲基化劑5-氮脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)處理后,hMLH1啟動子發(fā)生去甲基化,hMLH1蛋白重新表達,并使錯配修復系統(tǒng)的功能部分恢復。這一研究充分證明hMLH1啟動子高甲基化導致轉(zhuǎn)錄沉寂在結(jié)直腸癌發(fā)生中起重要作用。O6-MGMT是修復烷化鳥嘌呤的基因,該基因的高甲基化與食管鱗狀細胞癌發(fā)生有關(guān)。最近對食管癌的高發(fā)地區(qū)中國河南林縣的食管鱗狀細胞癌研究發(fā)現(xiàn),72%的癌中出現(xiàn)MGMT基因啟動子高甲基化,伴有MGMTmRNA及蛋白表達降低。該地區(qū)29%的正常人食管上皮中也出現(xiàn)MGMT甲基化,且隨著上皮細胞變異的惡性程度的加深,MGMT基因的甲基化發(fā)生率逐漸增加?？梢?啟動子甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件,甲基化的程度與腫瘤的惡性程度有關(guān),在胃癌等其他腫瘤的研究中也有相關(guān)報道。ToyoraM等對結(jié)直腸癌的細胞系中30個CpG島的甲基化狀態(tài)進行研究,將CpG島分為兩類:一類是年齡特異的CpG島(TypeA,aging-specific),它們隨年齡的增加發(fā)生甲基化的頻率逐漸增加,在正常人及腫瘤患者中均可出現(xiàn)甲基化;另一類是腫瘤特異的CpG島(TypeC,cancer-specific),它們僅在腫瘤組織中發(fā)生甲基化,正常狀態(tài)下從不發(fā)生甲基化,這類CpG島在腫瘤的發(fā)生中具有更重要的意義。而年齡特異的CpG島可以作為解釋隨年齡增長,腫瘤發(fā)生率增加的因素之一。1971年,KnudsonAG提出癌癥發(fā)生的“二次打擊”學說,認為只有當抑癌基因的兩個等位基因都失活時才能使該基因不表達,促使腫瘤形成。一個等位基因的甲基化可以與另一個等位基因的突變或雜合性缺失共同導致基因失活。然而,雙等位基因的甲基化也可以造成基因不表達。如人類結(jié)直腸癌中存在hMLH1雙等位基因的啟動子高甲基化,導致該基因失活,影響DNA錯配修復系統(tǒng)的功能。總之,正常細胞生長分化調(diào)控的多種基因都可以通過啟動子的異常高甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄,這些重要基因的不表達與多種腫瘤的形成有關(guān)。3.2細胞癌中的dna低甲基化是導致基因組不穩(wěn)定性缺失的重要原因之一對人類腫瘤的研究發(fā)現(xiàn),伴隨著特異基因的啟動子區(qū)出現(xiàn)異常高甲基化,整個基因組中普遍存在低甲基化,主要發(fā)生在DNA重復序列中,如微衛(wèi)星DNA、長散布元件(LINES)、Alu順序等,這種廣泛的低甲基化會造成基因組不穩(wěn)定,與多種腫瘤如肝細胞癌、尿道上皮細胞癌、宮頸癌等的發(fā)生有關(guān)。對36例肝細胞癌的1號染色體的微衛(wèi)星序列Sat2進行研究,發(fā)現(xiàn)69%肝細胞癌的Sat2DNA發(fā)生低甲基化,且Sat2DNA的低甲基化與染色體1q12斷裂、不正常的1q形成顯著相關(guān)。對尿道上皮細胞癌的研究同樣表明,位于1、9、16號染色體的Sat2、Sat3重復序列的低甲基化會造成該區(qū)的異染色質(zhì)解壓縮,從而使染色體重組的發(fā)生率提高,且這種重復序列的低甲基化與9號染色體的雜合性缺失的出現(xiàn)呈顯著相關(guān)。目前已證明尿道上皮細胞癌中9號染色體的雜合性缺失普遍存在。用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷(5-azacytidine)處理培養(yǎng)的細胞時,會誘導DNA低甲基化及微衛(wèi)星DNA的染色體重組。證明了DNA低甲基化是促使基因組不穩(wěn)定性的原因之一?？梢?甲基化的DNA可以保護基因組的穩(wěn)定,降低重復序列間的同源重組造成的染色體缺失、重排。當正常的甲基化位