PAGE植物分子育種教案沈法富PAGEi目錄第一編植物分子標記輔助育種（20學(xué)時）第一章遺傳標記概述（3學(xué)時）第一節(jié)遺傳標記的發(fā)展第二節(jié)遺傳標記的種類形態(tài)標記細胞學(xué)標記蛋白質(zhì)標記DNA標記第二章DNA標記技術(shù)（3學(xué)時）第一節(jié)DNA雜交的分子標記RFLP技術(shù)VNTR技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的分子標記隨機引物的PCR標記特異引物的PCR標記第三節(jié)限制性酶切和PCR的分子標記AFLP標記CAPS標記第四節(jié)單核苷酸多態(tài)性的DNA標記第三章分子圖譜的構(gòu)建（4學(xué)時）第一節(jié)作圖群體的建立第二節(jié)圖譜構(gòu)建的理論基礎(chǔ)第三節(jié)DNA標記分離數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)處理第四節(jié)DNA標記圖譜的完善第五節(jié)比較作圖第四章質(zhì)量性狀的分子標記（3學(xué)時）第一節(jié)近等基因系分析法第二節(jié)分離體分組混合分析法第五章數(shù)量性狀的分子標記（3學(xué)時）第一節(jié)數(shù)量性狀基因的初級定位第二節(jié)數(shù)量性狀基因的精細定位第六章分子標記輔助選擇技術(shù)（4學(xué)時）第一節(jié)質(zhì)量性狀的標記輔助選擇技術(shù)第二節(jié)數(shù)量性狀的標記輔助選擇技術(shù)第三節(jié)標記輔助選擇技術(shù)的應(yīng)用研究第四節(jié)分子標記輔助選擇的發(fā)展策略第一編轉(zhuǎn)基因植物育種（20學(xué)時）轉(zhuǎn)基因育種的基礎(chǔ)（4學(xué)時）目的基因的克隆與表達載體的構(gòu)建植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)基因植物的篩選與鑒定轉(zhuǎn)基因植物的遺傳規(guī)律轉(zhuǎn)基因植物與優(yōu)質(zhì)育種（3學(xué)時）改變植物貯藏蛋白的品質(zhì)調(diào)節(jié)碳水化合物的合成改善植物油脂的品質(zhì)改良棉花纖維品質(zhì)轉(zhuǎn)基因抗病育種（3學(xué)時）植物抗病基因的克隆抗植物病毒基因工程抗真菌植物基因工程轉(zhuǎn)基因抗蟲育種（3學(xué)時）Bt毒蛋白基因其他抗蟲基因植物轉(zhuǎn)基因抗蟲研究的進展轉(zhuǎn)基因抗非生物逆境育種（4學(xué)時）植物耐鹽基因工程耐旱基因工程抗除草劑基因工程抗寒冷基因工程第六章轉(zhuǎn)基因作物的安全性及其對策（3學(xué)時）轉(zhuǎn)基因作物的潛在風(fēng)險轉(zhuǎn)基因作物作為食品的安全性問題PAGEPAGE22第一章遺傳標記概述遺傳標記是指可以明確反映遺傳多態(tài)性的生物特征。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異。在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。遺傳標記可以幫助人們更好地研究生物的遺傳與變異規(guī)律。在遺傳學(xué)研究中遺傳標記主要應(yīng)用于連鎖分析、基因定位、遺傳作圖及基因轉(zhuǎn)移等。在作物育種中通常將與育種目標性狀緊密連鎖的遺傳標記用來對目標性狀進行追蹤選擇。在現(xiàn)代分子育種研究中，遺傳標記的應(yīng)用已成為基因定位和輔助選擇的主要手段?？v觀遺傳學(xué)的發(fā)展歷史，每一種新型遺傳標記的發(fā)現(xiàn)，都大大推進了遺傳學(xué)的發(fā)展。第一節(jié)遺傳標記的發(fā)展19世紀后半葉，孟德爾（G.Ｊ.Mendel）以豌豆為材料，利用七對外部形態(tài)特征差異明顯、易于識別的相對性狀，對雜種后代的不同個體依性狀表現(xiàn)進行歸類分析，提出了“遺傳因子”假說，并發(fā)現(xiàn)了生物遺傳的分離規(guī)律和獨立分配規(guī)律，即著名的孟德爾定律。1910年，摩爾根（T.H.Morgan）在哥倫比亞大學(xué)的實驗室發(fā)現(xiàn)一種奇特的果蠅，它的眼色不是野生型的紅色而是白色，摩爾根用白眼雄蠅與野生型雜交，發(fā)現(xiàn)在F1代中白眼為隱性性狀，在F2代中紅眼與白眼的遺傳符合孟德爾分離規(guī)律。但是在按雌雄性別分別記數(shù)時發(fā)現(xiàn)了異?，F(xiàn)象，雌蠅全部為紅眼，雄蠅中一半為紅眼一半為白眼。由此發(fā)現(xiàn)決定眼色的基因與決定性別的基因是連鎖遺傳的，從而產(chǎn)生了著名的摩爾根遺傳學(xué)說。果蠅白眼遺傳標記的發(fā)現(xiàn)成為近代遺傳學(xué)研究的一個里程碑。1913年，A.H.Sturtevant通過連鎖遺傳分析成功地在果蠅的X染色體上定位了5個基因，從此確定了遺傳學(xué)的染色體理論和遺傳作圖的基本原理。1910年以后，摩爾根將孟德爾“遺傳因子”的行為與染色體的行為結(jié)合起來進行研究，證實了“遺傳因子”是染色體上占有一定位置的實體，由此導(dǎo)致了細胞遺傳學(xué)的誕生。通過對不同物種染色體形態(tài)、數(shù)目和結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)各種非整倍體、染色體結(jié)構(gòu)變異以及各種異形染色體等都有其特定的細胞學(xué)特征，可以作為一種遺傳標記來測定基因所在的染色體及其相對位置，或通過染色體代換等遺傳操作進行基因定位。這種能明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學(xué)特征，通稱為細胞學(xué)標記。1941年，美國遺傳學(xué)家G.W.Beadle和生化學(xué)家E.L.Tatum通過研究紅色面包霉的生化突變型，對一系列營養(yǎng)缺陷型進行遺傳分析，提出了“一個基因一個酶”的假說，創(chuàng)立了生化遺傳學(xué)。50年代許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)同一種酶可具有多種不同的形式。同時由于淀粉凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展和組織化學(xué)染色劑的使用，使這種酶的多種形式成為肉眼可辯的帶型——酶譜。1959年，C.L.Markert和F.Moller根據(jù)對幾種動物乳糖脫氫酶的多種形式的研究，提出了用同工酶（isozyme）一詞來描述具有同一底物專一性的不同分子形式的酶，并證實了同工酶具有組織、發(fā)育及物種的特異性。通過同工酶的電泳譜帶可以清楚地識別同工酶的基因型，因此可以作為一種遺傳標記加以利用，并且可以將編碼酶的基因通過遺傳分析定位在染色體上。同工酶標記是建立在生化遺傳學(xué)基礎(chǔ)上的，所以又稱為生化標記或蛋白質(zhì)標記。蛋白質(zhì)標記是一種分子標記，但仍是以基因表達的結(jié)果（表現(xiàn)型）為基礎(chǔ)的，是對基因的間接反映。1953年，J.D.Watson和F.H.C.Crick提出了DNA分子結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，圓滿地解釋了DNA就是基因的有機化學(xué)實體，宣布了分子遺傳學(xué)時代的到來?，F(xiàn)代基因概念的發(fā)展使直接利用DNA分子中核苷酸序列的變異作為遺傳標記成為可能。1980年，人類遺傳學(xué)家D.R.L.Botstein等首先提出了DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）可以作為遺傳標記的思想，開創(chuàng)了直接應(yīng)用DNA多態(tài)性發(fā)展遺傳標記的新階段。RFLP標記的誕生大大加速了各種生物遺傳圖譜的建立和發(fā)展，同時也提高了基因定位的精度和速度。1985年，DNA多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)的誕生，使直接體外擴增DNA以檢測其多態(tài)性成為可能。1990年，J.G.K.Williams等和J.Welsh等兩個研究小組應(yīng)用PCR技術(shù)同時發(fā)展了一種新的RAPD分子標記。隨后，基于PCR技術(shù)的新型分子標記不斷涌現(xiàn)，使得DNA標記走向商業(yè)化、實用化。由形態(tài)標記向分子標記逐步發(fā)展的過程，體現(xiàn)了人類對于基因由現(xiàn)象到本質(zhì)的認識發(fā)展過程。在這一過程中，傳統(tǒng)的形態(tài)標記和細胞學(xué)標記始終是遺傳標記發(fā)展的基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)標記和DNA標記則是遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展導(dǎo)致遺傳標記發(fā)展的必然結(jié)果。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，新型的分子標記還將不斷涌現(xiàn)，新近發(fā)展的基于DNA測序和DNA芯片技術(shù)的SNP標記已為DNA標記技術(shù)的發(fā)展展示了美好的前景。第二節(jié)遺傳標記的種類一、形態(tài)標記形態(tài)標記是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)性的外觀性狀，如株高、穗形、粒色或芒毛等的相對差異。典型的形態(tài)標記用肉眼即可識別和觀察。廣義的形態(tài)標記還包括那些借助簡單測試即可識別的某些性狀如生理特性、生殖特性、抗病蟲性等。由自發(fā)突變或物理化學(xué)誘變均可獲得具有特定形態(tài)特征的遺傳標記材料。例如在組織培養(yǎng)及誘變育種過程中經(jīng)常出現(xiàn)的大量變異材料，其中不乏在形態(tài)特征或生理特性上具有特殊表型的個體，經(jīng)過選擇，就可獲得穩(wěn)定遺傳的形態(tài)標記材料。形態(tài)標記材料多數(shù)僅帶有一個標記基因，但有的則帶有多個標記基因。后者用于基因連鎖分析時，可同時分析幾個標記性狀。形態(tài)標記材料在遺傳研究和作物育種上都有重要的應(yīng)用價值，因此對形態(tài)標記材料的收集、保存和利用歷來受到各國研究者的重視。在水稻中，目前已有的形態(tài)標記材料，大多是經(jīng)過精心選育獲得的。國際水稻所和日本系統(tǒng)地收集了大量的形態(tài)標記材料，并作為重要的種質(zhì)資源加以保存。在水稻中已有多達300多個形態(tài)標記材料。在番茄中已發(fā)現(xiàn)的形態(tài)標記也有300多種，其中苗期無花色素標記與抗煙草花葉病毒病的Tm-2基因連鎖，葉狀腺的大小與抗桃霉病基因連鎖。在大豆中也積累了大量的形態(tài)標記材料，其中部分標記基因已定位在相應(yīng)的連鎖群上（表1.1）。形態(tài)標記基因的染色體定位最初是通過經(jīng)典的二點、三點測驗進行的。通過判斷不同性狀間的遺傳是否符合獨立分配規(guī)律，來確定控制這些性狀的基因是否連鎖。采用這種方法把相互連鎖在一起的基因定為一個連鎖群，并與染色體相對應(yīng)，以性狀間重組率作為這些基因在染色體上的相對距離，并確定其毗鄰關(guān)系。1910年，摩爾根領(lǐng)導(dǎo)的實驗室根據(jù)對果蠅六個形態(tài)性狀的分析，發(fā)現(xiàn)了連鎖遺傳現(xiàn)象，并根據(jù)研究性狀與形態(tài)標記的連鎖關(guān)系，構(gòu)建了生物中第一張遺傳連鎖圖，開創(chuàng)了利用已知染色體相對位置的標記基因定位未知基因的先例。1928年，趙蓮芳根據(jù)8個水稻品種的雜交資料，研究了莖、葉和穎花等器官的顏色、護穎長度、谷粒外形等12種性狀的遺傳，由其中9個基因的相互關(guān)系，確定了水稻的三個連鎖群。借助于這種方法在一些栽培物種中確定了許多質(zhì)量性狀基因的連鎖關(guān)系及其在染色體上的相對位置，并繪制出較為完整的遺傳連鎖圖譜。以形態(tài)標記為基礎(chǔ)的連鎖群的建立為生理、生化性狀的遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。由于形態(tài)標記數(shù)量少、可鑒別標記基因有限，因而難以建立飽和的遺傳圖譜。另外，許多形態(tài)標記還受環(huán)境、生育期等因素的影響，使形態(tài)標記在植物育種中的應(yīng)用受到一些限制。

表1.1 大豆部分形態(tài)標記性狀及標記基因（ShoemakerandOlson1993）標記性狀標記基因（括號內(nèi)數(shù)字表示所在連鎖群）色素花色W1，w1（8）茸毛色T，t（1）莢色L1，l1（5）；L2，l2種皮G，g（3）種臍R，r-m（2）；I，i-i，I-k，i（7）雙色K1；K2；K3子葉色D1（3）；D2；Cyt-G，Y3葉小葉數(shù)目L-f1，l-f2葉形ln（4）；Lo，lo；l-w1，l-w2；l-b1,l-b2；落葉性A葉綠素缺失V1；y3；y4；…y20茸毛類型Pa1，pa1；Pa2，pa2；P1，p1（2）；P2，p2（4）；Pb，pb（14）；Pc，pc；Pd1，pd2；Ps，ps莖扁化莖f(11)節(jié)間長度S，s短葉柄Lps，lps矮桿df2（6）；df3；df4；df5（1）花花序長短Se，se開花和成熟E1，e1（1）；E2，e2；E3，e3；E4，e4；E5，e5無限結(jié)莢習(xí)性Dt1，dt1（5）；Dt2，dt2種子種皮健全度De，de種皮泥膜B1；B2；B3根根部熒光fr1（12）；fr2；fr4；Fr3根瘤菌反應(yīng)rj1（11）；Rj2；Rj3；Rj4雄性不育染色體聯(lián)會突變st2；st3；st4；st5（8）花藥開裂不良Ft花絲伸長不良fs1；fs2雄性不育突變體P2（4）；ms1（8）；ms2；ms3；ms4；ms5；ms6（8）抗病性大豆灰斑病Rcs1；Rcs2大豆霜霉病Rpm白粉病Rmd大豆疫根腐病Rps（10）大豆銹病Rpp1；Rpp2；Rpp3細菌性斑點病Rpg1細菌性斑疹病Rxp大豆花葉病毒病Rsv1（13）；Rsv2大豆孢囊線蟲病rhg1；rhg2；rhg3；Rhg4；二、細胞學(xué)標記細胞學(xué)標記是指能明確顯示遺傳多態(tài)性的細胞學(xué)特征。染色體的結(jié)構(gòu)特征和數(shù)量特征是常見的細胞學(xué)標記，它們分別反映了染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性。染色體結(jié)構(gòu)特征包括染色體的核型和帶型。核型特征是指染色體的長度、著絲粒位置和隨體有無等，由此可以反映染色體的缺失、重復(fù)、倒位和易位等遺傳變異；帶型特征是指染色體經(jīng)特殊染色顯帶后，帶的顏色深淺、寬窄和位置順序等，由此可以反映染色體上常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的分布差異。染色體數(shù)量特征是指細胞中染色體數(shù)目的多少，染色體數(shù)量上的遺傳多態(tài)性包括整倍性和非整倍性的變異，前者如多倍體，后者如缺體、單體、三體、端著絲點染色體等非整倍體。用具有染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的材料與染色體正常的材料進行雜交，其后代常導(dǎo)致特定染色體上的基因在減數(shù)分裂過程中的分離和重組發(fā)生偏離，由此可以測定基因所在的染色體及其相對位置。因此，染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的特征可以作為一種遺傳標記。在玉米中利用B-A易位系，水稻中利用易位系，小麥中利用端著絲點染色體，大麥中利用端著絲點三體，棉花中利用易位和單體等非整倍體，番茄中利用各種三體，煙草中利用單體，已成功地將許多質(zhì)量性狀基因定位于染色體上，并建立了相應(yīng)的連鎖群。染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變異常具有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)特征，在多倍體植物中廣泛用于基因定位研究。在小麥中，利用每條染色體的模式圖、C-分帶的帶型、缺失斷點的位置及分子標記在缺失間隔區(qū)的定位，構(gòu)建了整個小麥基因組的物理圖譜。由于染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變異常具有相應(yīng)的形態(tài)特征，因此，培育這樣的細胞學(xué)標記材料，可以在雜種后代中直接對相應(yīng)的形態(tài)標記進行選擇，不必進行染色體鑒定就可確定其細胞學(xué)特征，從而提高細胞學(xué)標記的利用效率。表1.2給出了二倍體秈稻品種IR36的12條染色體的初級三體的形態(tài)特征。根據(jù)這些形態(tài)特征，在一般情況下可將這些初級三體與IR36區(qū)別開來。表1.2 水稻IR36初級三體的形態(tài)特征(Khushetal.1984)染色體三體名稱特征1三體1（草狀）生長緩慢，高度不育，籽粒較細長且稍呈三角形，葉窄，與草相似2三體2（矮生）小穗短，護穎較長，自交高度不育，葉片短且基部附近常扭曲3三體4（不育）植株最矮，葉片短厚呈革質(zhì)，中脈凸出，穗伸出不完全，自交完全不育4三體12（高稈）植株最高，葉片下垂，葉舌長，育性正常5三體5（葉片扭曲）葉片短且扭曲，有密生茸毛，穗短，小穗著生緊密，結(jié)實率高6三體3（有芒）籽粒有芒，葉片厚而半卷，葉舌長，自交高度不育7三體7（窄葉）葉片窄而半卷，穗稍疏松，不完全伸出，部分可育8三體8（卷葉）葉片窄卷，葉舌短，籽粒短而粗，部分可育9三體9（粗壯）葉片厚而濃綠，莖稈短，小穗最大，百粒重最高10三體10（短粒）葉舌有毛，葉片直立，育性正常11三體11（擬正常）形態(tài)與二倍體姊妹系無法區(qū)別，育性正常，需作細胞學(xué)鑒定12三體6（叢生）外型呈叢生草狀，穗部頂端小穗退化，育性高細胞學(xué)標記克服了形態(tài)標記易受環(huán)境影響的缺點，但這種標記材料的產(chǎn)生需要花費大量的人力物力進行培養(yǎng)選擇。有些物種對染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變異的耐受性較差，難以獲得相應(yīng)的標記材料。某些物種雖然已有細胞學(xué)標記材料，但這些標記常常伴有對生物有害的表型效應(yīng)，或有時觀察和鑒定比較困難，從而限制了細胞學(xué)標記的應(yīng)用。三、蛋白質(zhì)標記許多生物大分子或生物化合物都具有作為遺傳標記的潛力。酚類化合物、黃酮類化合物、花色素苷及糖苷類分子曾被用作為分子標記（Mckee1973）。但由于分離和檢測這些分子的技術(shù)和手段通常比較復(fù)雜，而且費時費錢，使之很難適合于大群體的常規(guī)檢測，因此這類生化物質(zhì)作為遺傳標記是不理想的。與此相反，許多蛋白質(zhì)分子分析簡單快捷，是有用且可靠的遺傳標記。用作遺傳標記的蛋白質(zhì)通?？煞譃槊傅鞍踪|(zhì)和非酶蛋白質(zhì)二種。在非酶蛋白質(zhì)中，用得較多的是種子貯藏蛋白，這些蛋白質(zhì)可以通過一維或二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)進行分析，根據(jù)電泳顯示的蛋白質(zhì)譜帶或點，確定其分子結(jié)構(gòu)和組成的差異。種子貯藏蛋白在小麥、大麥、玉米、水稻等作物上的研究工作比較深入，如小麥種子貯藏蛋白中醇溶蛋白和谷蛋白約占蛋白質(zhì)總量的90%，對其遺傳分析表明，它們是極為重要的生化遺傳指標，并已被廣泛地應(yīng)用于小麥的遺傳學(xué)研究。酶蛋白質(zhì)通常利用非變性淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳及特異性染色來檢測，根據(jù)電泳譜帶的不同來顯示酶蛋白在遺傳上的多態(tài)性。蛋白質(zhì)的多態(tài)性，可能是由于基因編碼的氨基酸序列的差異引起的，也可能是由于蛋白質(zhì)后加工的不同引起的，如糖基化能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子量的變化。酶作為遺傳標記是在Markert和Moller（1959）提出了同工酶的概念后迅速發(fā)展起來的。同工酶是指具有相同催化功能而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)又不同的一類酶，其結(jié)構(gòu)的差異來源于基因類型的差異，因此并不一定是同一基因的產(chǎn)物。每一個酶的不同電泳酶譜表現(xiàn)型可能是由于不同的基因座引起的，也可能是同一基因座上的不同的等位基因引起的。為了易于區(qū)別，又將后一類同工酶稱為等位酶（Allozymes）。由于等位基因的差異，等位酶在氨基酸組成上或多或少也有差異。同工酶不但已被用來標記某些重要的質(zhì)量性狀，如番茄的線蟲病抗性，而且還用于標記復(fù)雜的數(shù)量性狀，如種子大小、產(chǎn)量等。編碼同工酶的基因可以通過遺傳分析定位于染色體或連鎖群上。在一些重要農(nóng)作物中，如水稻、大豆等，已定位了許多同工酶基因（表1.3,）。蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物，與形態(tài)性狀、細胞學(xué)特征相比，數(shù)量上更豐富，受環(huán)境影響更小，能更好地反映遺傳多態(tài)性，因此蛋白質(zhì)標記是一種較好的遺傳標記，已被廣泛應(yīng)用于物種起源和進化研究、種質(zhì)鑒定、分類和抗病性篩選等領(lǐng)域。但蛋白質(zhì)標記仍然存在諸多不足，如每一種同工酶標記都需特殊的顯色方法和技術(shù)；某些酶的活性具有發(fā)育和組織特異性；局限于反映基因組編碼區(qū)的表達信息等。最關(guān)鍵的不足是其標記的數(shù)量還比較有限。雖然至今已經(jīng)發(fā)展了57種酶系統(tǒng)（VallegosandChase1991），大約可以鑒定100個左右的基因座位，但在某個特定的作物群體中，僅有10~20種同工酶，大約30~40個等位基因可表現(xiàn)出多態(tài)性。這樣的數(shù)目還不能滿足標記輔助育種的需要。

表1.3 水稻同工酶標記同工酶基因染色體酸性磷酸酶Acp-112Acp-212Acp-37乙醇脫氫酶Adh-111氨基肽酶Amp-12Amp-28Amp-36Amp-48β-淀粉酶β-Amy-17過氧化氫酶Cat-16內(nèi)肽酶Enp-16酯酶Est-26Est-39Est-51Est-77Est-97谷氨酸脫氫酶Gdh-13天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶Got-11Got-26異檸檬酸脫氫酶Icd-11蘋果酸脫氫酶Mal-11過氧化物酶Pox-15Pox-212Pox-56M-Pox-15磷酸葡萄糖異構(gòu)酶Pgi-13Pgi-26磷酸葡萄糖脫氫酶Pgd-111Pgd-26四、DNA標記DNA分子標記是DNA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA水平的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異，哪怕是單個核苷酸的變異。因此，DNA標記在數(shù)量上幾乎是無限的。與以往的遺傳標記相比，DNA標記還有許多特殊的優(yōu)點，如無表型效應(yīng)、不受環(huán)境限制和影響等。目前，DNA標記已廣泛地應(yīng)用于種質(zhì)資源研究、遺傳圖譜構(gòu)建、目的基因定位和分子標記輔助選擇等各個方面。理想的DNA標記應(yīng)具備以下特點：（1）遺傳多態(tài)性高；（2）共顯性遺傳，信息完整；（3）在基因組中大量存在且分布均勻；（4）選擇中性；（5）穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好；（6）信息量大，分析效率高；（7）檢測手段簡單快捷，易于實現(xiàn)自動化；（8）開發(fā)成本和使用成本低。目前已發(fā)展出十幾種DNA標記技術(shù)，它們各具特色，并為不同的研究目標提供了豐富的技術(shù)手段。但還沒有一種DNA標記能完全具備上述理想特性。依據(jù)對DNA多態(tài)性的檢測手段，DNA標記可分為四大類：第一類為基于DNA-DNA雜交的DNA標記。該標記技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標記的特異DNA探針與之進行雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。其中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和應(yīng)用廣泛的RFLP標記。第二類為基于PCR的DNA標記。PCR技術(shù)問世不久，便以其簡便、快速和高效等特點迅速成為分子生物學(xué)研究的有力工具，尤其是在DNA標記技術(shù)的發(fā)展上更是起到了巨大作用。根據(jù)所用引物的特點，這類DNA標記可分為隨機引物PCR標記和特異引物PCR標記。隨機引物PCR標記包括RAPD標記、ISSR標記等，其中RAPD標記使用較為廣泛。隨機引物PCR所擴增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機性和任意性，因此隨機引物PCR標記技術(shù)可用于對任何未知基因組的研究。特異引物PCR標記包括SSR標記、STS標記等，其中SSR標記已廣泛地應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等領(lǐng)域。特異引物PCR所擴增的DNA區(qū)段是事先已知的明確的，具有特異性。因此特異引物PCR標記技術(shù)依賴于對各個物種基因組信息的了解。第三類為基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNA標記。這類DNA標記可分為二種類型，一種是通過對限制性酶切片段的選擇性擴增來顯示限制性片段長度的多態(tài)性，如AFLP標記。另一種是通過對PCR擴增片段的限制性酶切來揭示被擴增區(qū)段的多態(tài)性，如CAPS標記。第四類為基于單核苷酸多態(tài)性的DNA標記。如：SNP標記。它是由DNA序列中因單個堿基的變異而引起的遺傳多態(tài)性。目前SNP標記一般通過DNA芯片技術(shù)進行分析。以上四大類DNA標記，都是基于基因組DNA水平上的多態(tài)性和相應(yīng)的檢測技術(shù)發(fā)展而來的，這些標記技術(shù)都各有特點。表1.5和圖1.1分別描述了一些主要的DNA標記的特點和遺傳多態(tài)性的分子基礎(chǔ)。任何DNA變異能否成為遺傳標記都有賴于DNA多態(tài)性檢測技術(shù)的發(fā)展，DNA的變異是客觀的，而技術(shù)的進步則是人為的。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，隨時可能誕生新的標記技術(shù)。DNA標記的拓展和廣泛應(yīng)用，最終必然會促進作物遺傳與育種研究的深入發(fā)展。RFLPVNTRRAPDISSRSSRAFLP基因組分布低拷貝編碼序列整個基因組整個基因組整個基因組整個基因組整個基因組遺傳特點多態(tài)性共顯性中等共顯性較高多數(shù)顯性較高顯性/共顯性較高共顯性高顯性/共顯性較高檢測基因座位數(shù)1-310-1001-101-10多數(shù)為120-200探針/引物類型gDNA或cDNA特異性低拷貝探針DNA短片段9-10bp隨機引物16-18bp特異引物14-16bp特異引物16-20bp特異引物DNA質(zhì)量要求高高低低中等高DNA用量2-10μg5-10μg10-25ng25-50ng25-50ng2-5μg技術(shù)難度高中等低低低中等同位素使用情況通常用通常用不用不用可不用通常用可靠性高高低/中等高高高耗時多多少少少中成本高高較低較低中等較高第二章DNA標記技術(shù)生命的遺傳信息存儲于DNA序列之中，高等生物每一個細胞的全部DNA構(gòu)成了該生物體的基因組。基因組DNA序列的變異是物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)。盡管在生命信息的傳遞過程中DNA能夠精確地自我復(fù)制，但是許多因素也能引起DNA序列的變化，造成個體之間的遺傳差異。單個堿基的替換、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等都能引起DNA序列的變異。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)揭示DNA序列的變異（遺傳多態(tài)性），就可以建立DNA水平上的遺傳標記。從1980年人類遺傳學(xué)家J.G.K.Botstein等首次提出DNA限制性片段長度多態(tài)性作為遺傳標記的思想及1985年P(guān)CR技術(shù)的誕生至今，已經(jīng)發(fā)展了十多種基于DNA多態(tài)性的分子標記技術(shù)，這些DNA標記技術(shù)綜合起來可分為以DNA雜交為基礎(chǔ)的和以PCR為基礎(chǔ)的以及PCR技術(shù)和限制性酶切技術(shù)相結(jié)合的幾種類型。顯然，檢測DNA水平上的遺傳變異最精確的方法是直接測定DNA序列，通過對測定的DNA序列進行分析比較，即可揭示生物體間在單個核苷酸水平上的遺傳多態(tài)性。基于這一原理，最近發(fā)展了SNP標記，即單核苷酸多態(tài)性標記。盡管在植物分子標記研究中還未見這一技術(shù)的應(yīng)用報道，但其應(yīng)用前景是十分美好的。因此，本章在最后一節(jié)對這一新技術(shù)作了簡要闡述。第一節(jié)基于DNA-DNA雜交的DNA標記基于DNA-DNA雜交的DNA標記主要包括RFLP標記和VNTR標記。這類標記是利用限制性內(nèi)切酶酶解不同生物體的DNA分子后，用同位素或非同位素標記的隨機基因組克隆、cDNA克隆、微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列等作為探針進行DNA間雜交，通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNA的多態(tài)性。VNTR多態(tài)性是由重復(fù)序列數(shù)目的差異性產(chǎn)生的，而RFLP多態(tài)性主要是由于DNA序列中單堿基的替換、DNA片段的插入、缺失、易位和倒位等引起的。RFLP標記是發(fā)現(xiàn)最早、應(yīng)用廣泛、具有代表性的DNA標記技術(shù)。一、RFLP標記技術(shù)RFLP即限制性片段長度多態(tài)性。這種多態(tài)性是由于限制性內(nèi)切酶酶切位點或位點間DNA區(qū)段發(fā)生突變引起的。限制性內(nèi)切酶是一種能識別DNA上特定堿基組成的序列并在這些序列位點上切斷DNA分子的酶。這些特定堿基組成的DNA序列叫做相應(yīng)內(nèi)切酶的識別位點或限制性位點，長度一般在4至8個堿基對之間。如PstⅠ的限制性位點是（其中箭頭表示被切開的位置）：5’CTGCA↓G3’3’G↑ACGTC5’通常DNA上存在大量的限制性內(nèi)切酶酶切位點。因此，限制性內(nèi)切酶能將很長的DNA分子酶解成許多長短不一的小片段，片段的數(shù)目和長度反映了DNA分子上限制性酶切位點的分布。特定的DNA／限制性內(nèi)切酶組合所產(chǎn)生的片段是特異的，它能作為某一DNA（或含有該DNA的生物）的特有“指紋”，這種“指紋”在DNA分子水平上直接反映了生物的遺傳多態(tài)性。圖2.1給出了產(chǎn)生RFLP的原理示意圖。如果某一個限制性位點發(fā)生了突變，這個限制性內(nèi)切酶將不再識別這個位點，不再進行酶切反應(yīng)，產(chǎn)生片段的大小將由最鄰近的限制性酶切位點決定。由于植物基因組很大，某種限制性內(nèi)切酶的酶切位點很多，經(jīng)酶解后會產(chǎn)生大量大小不一的限制性片段，這些片段經(jīng)電泳分離形成的電泳譜帶是連續(xù)分布的，很難辨別出某一限制性片段大小的變化，必須利用單拷貝的基因組DNA克隆或cDNA克隆作為探針，通過Southern雜交技術(shù)才能夠檢測到?？梢?，要進行RFLP分析首先要分離單拷貝的基因組DNA克隆或cDNA克隆，才能進行多態(tài)性分析。一些作物如玉米、水稻、番茄等已有覆蓋整個基因組的克隆，很容易從有關(guān)單位或商家索取或購買到。但大多數(shù)作物還沒有覆蓋整個基因組的克隆，仍需要研制特異探針。由于具有大量的酶和探針組合可供選配，因此任何一種作物都具有大量的RFLP標記數(shù)量。RFLP標記具有共顯性、信息完整、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點。但RFLP技術(shù)的實驗操作過程較復(fù)雜，需要對探針進行同位素標記，即使應(yīng)用非放射性的Southern雜交技術(shù)，仍然是個耗時費力的過程。圖2.1 RFLP標記多態(tài)性的分子基礎(chǔ)二、VNTR標記技術(shù)許多生物體的DNA存在含有大量的串聯(lián)重復(fù)序列的高變異區(qū)。通常將以15～75個核苷酸為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列稱為小衛(wèi)星（Minisatellites），以2～6個核苷酸為基本單元的簡單串聯(lián)重復(fù)序列稱為微衛(wèi)星（Microsatellites）或簡單序列重復(fù)（SSR）。小衛(wèi)星和微衛(wèi)星也常常稱作重復(fù)數(shù)可變串聯(lián)重復(fù)（VNTR）標記。VNTR標記產(chǎn)生的多態(tài)性是由同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的。圖2.2為VNTR變異的原理示意圖。利用VNTR標記可進行分子定位和作圖的研究工作。圖2.2 VNTR變異的原理示意圖.A、B、C分別表示不同基因型為了使VNTR成為有用的DNA標記，需發(fā)展一種能夠快速鑒定VNTR座位的技術(shù)。理想的途徑之一是利用PCR進行擴增，所得PCR產(chǎn)物通過電泳即可比較其長度變異。但是許多小衛(wèi)星序列太長，無法通過PCR擴增獲得滿意的結(jié)果。因此，仍需利用DNASouthern雜交和放射性標記探針來檢測。而微衛(wèi)星序列常常比較短，利用PCR擴增可以獲得滿意的檢測效果。鑒于上述原因，本書中將微衛(wèi)星標記歸類于基于PCR技術(shù)的DNA標記。本節(jié)中的VNTR標記主要是指小衛(wèi)星標記。利用小衛(wèi)星中的重復(fù)單元作為雜交探針是獲得VNTR信息的最快捷的途徑。在動物基因組中存在大量的小衛(wèi)星標記，目前人類小衛(wèi)星序列和噬菌體M13蛋白III基因序列已成為研究小衛(wèi)星的常用探針。這些探針與植物基因組有較高的同源性，因此可以用于植物基因組的小衛(wèi)星研究。利用DNASouthern雜交技術(shù)可以產(chǎn)生許多多態(tài)性條帶。這些豐富的DNA帶譜用于DNA指紋研究是非常有用的，但由于帶譜復(fù)雜，現(xiàn)有技術(shù)分析起來比較困難，不太適合作圖研究。第二節(jié)基于PCR技術(shù)的DNA標記PCR技術(shù)是一種利用酶促反應(yīng)對特定DNA片段進行體外擴增的技術(shù)，該技術(shù)只需非常少量（通常在納克級范圍內(nèi)）的DNA樣品，在短時間內(nèi)以樣品DNA為模板合成上億個拷貝。經(jīng)過電泳分離、染色或放射自顯影，即可顯示出所擴增的特定DNA區(qū)段。PCR技術(shù)以短核苷酸序列作為引物，并使用一種耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。典型的PCR技術(shù)通常進行25～50個循環(huán)，每個循環(huán)包括三個步驟。第一步為DNA變性，通常將溫度升至94℃，使模板DNA變成單鏈；第二步為DNA復(fù)性，依據(jù)引物序列的長度及其與樣品DNA中目標序列的同源性程度等因素，將溫度控制在25～65℃，使引物與模板上的同源序列結(jié)合；第三步為DNA合成，所用溫度應(yīng)選擇最適合DNA聚合酶活性的溫度，通常為72℃。經(jīng)過這樣一個循環(huán)，目標DNA片段即被復(fù)制一次。隨著循環(huán)數(shù)的增加，DNA擴增產(chǎn)物呈指數(shù)增加。PCR技術(shù)具有快捷、簡易、靈敏等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于分子克隆、遺傳病的基因診斷、法醫(yī)學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、遺傳學(xué)和育種學(xué)等方面，在DNA標記技術(shù)的發(fā)展上起到了巨大的作用。根據(jù)所用引物的類型不同，基于PCR的DNA標記可分為隨機引物的PCR標記和特異引物的PCR標記。一、隨機引物的PCR標記隨機引物PCR標記的特點是，其所用引物的核苷酸序列是隨機的，其擴增的DNA區(qū)段是事先未知的。應(yīng)用這種標記技術(shù)可在基因組中尋找未知的多態(tài)性座位作為新的DNA標記。隨機引物PCR擴增的DNA區(qū)段產(chǎn)生多態(tài)性的分子基礎(chǔ)是模板DNA擴增區(qū)段上引物結(jié)合位點的堿基序列發(fā)生了突變。因此，不同來源的基因組在該區(qū)段（座位）上將表現(xiàn)為擴增產(chǎn)物有無的差異或擴增片段大小的差異（圖2.3）。其中第一種情況較為常見，因此隨機引物PCR標記通常是顯性的，但有時也會表現(xiàn)為共顯性，即擴增片段大小的差異。目前，常用的隨機引物PCR標記主要有可分為RAPD、AP-PCR、DAF、ISSR等。（一）RAPD標記RAPD標記所用的引物長度通常為9～10個堿基，大約只有常規(guī)的PCR引物長度的一半。使用這么短的PCR引物是為了提高揭示DNA多態(tài)性的能力。由于引物較短，所以在PCR中必須使用較低的退火（DNA復(fù)性）溫度，以保證引物能與模板DNA結(jié)合。RAPD引物已經(jīng)商品化，可以向有關(guān)供應(yīng)商直接購買，不需要自己合成。商品化的RAPD引物基本能覆蓋整個基因組，檢測的多態(tài)性遠遠高于RFLP。RAPD標記的優(yōu)點是，對DNA需要量極少，對DNA質(zhì)量圖2.3 隨機引物PCR產(chǎn)物多態(tài)性的分子基礎(chǔ).類型1為顯性標記，是最常見的多態(tài)性，類型2、3、4為共顯性標記，但較少見

要求不高，操作簡單易行，不需要接觸放射性物質(zhì)，一套引物可用于不同生物的基因組分析，可檢測整個基因組。在RAPD標記分析中，通常每次PCR反應(yīng)只使用一種引物。在這種情況下，只有兩端同時具有某種PCR引物結(jié)合位點的DNA區(qū)段才能被擴增出來。如果將2種引物組合使用，則還可擴增出兩端分別具有其中一種引物的結(jié)合位點的DNA區(qū)段，產(chǎn)生新的帶型，找到更多的DNA分子標記。在實驗材料多態(tài)性程度較低時，可考慮用這種將不同引物組合使用的方法。RAPD標記的不足之處是，一般表現(xiàn)為顯性遺傳，不能區(qū)分顯性純合和雜合基因型，因而提供的信息量不完整。另外，由于使用了較短的引物，RAPD標記的PCR易受實驗條件的影響，結(jié)果的重復(fù)性較差。不過，只要擴增到的RAPD片段不是重復(fù)序列，則可將其從凝膠上回收并克隆，轉(zhuǎn)化為RFLP和SCAR標記，以進一步驗證RAPD分析的結(jié)果。（二）DAF標記DAF標記原理上與RAPD標記相似，但它所使用的引物比RAPD標記的更短，一般為5～8個核苷酸，因而與模板DNA隨機結(jié)合的位點更多，擴增得到的DNA條帶也更多，檢測多態(tài)性的能力更強。在多態(tài)性程度比較低的作物如小麥上，DAF技術(shù)是一種很有用的尋找DNA分子標記的手段。但由于DAF使用了更短的引物，因而其PCR穩(wěn)定性比RAPD更低。（三）AP-PCR標記AP-PCR標記原理上也與RAPD相似，但所使用的引物較長，通常為18～24個堿基。因此，其PCR反應(yīng)條件與常規(guī)一樣，穩(wěn)定性要比RAPD好，但揭示多態(tài)性的能力要比RAPD低。（四）ISSR標記簡單序列重復(fù)間區(qū)（ISSR）DNA標記技術(shù)是由Zietkiewicz等（1994）提出的，該技術(shù)檢測的是兩個SSR之間的一段短DNA序列上的多態(tài)性。利用真核生物基因組中廣泛存在的SSR序列，設(shè)計出各種能與SSR序列結(jié)合的PCR引物，對兩個相距較近、方向相反的SSR序列之間的DNA區(qū)段進行擴增。一般在引物的5’或3’端接上2～4個嘌呤或嘧啶堿基，以對具有相同重復(fù)形式的許多SSR座位進行篩選，使得最終擴增出的ISSR片段不致太多。ISSR技術(shù)所用的PCR引物長度在20個核苷酸左右，因此可以采用與常規(guī)PCR相同的反應(yīng)條件，穩(wěn)定性比RAPD好。ISSR標記呈孟德爾式遺傳，具顯性或共顯性特點。在動植物基因組中存在大量的雙核苷酸重復(fù)序列，因此，大多數(shù)ISSR標記所用PCR引物是基于雙核苷酸重復(fù)序列的。近年來，ISSR標記技術(shù)已應(yīng)用于植物遺傳分析的各個方面，如品種鑒定、遺傳關(guān)系及遺傳多樣性分析、基因定位、植物基因組作圖研究等。Kojima等（1998）的研究表明，(AC)n雙核苷酸重復(fù)序列非常適合小麥的染色體作圖，并成功地定位了一系列ISSR標記。Tsumura等（1996）研究發(fā)現(xiàn)，基于(AG)n和(CT)n序列的ISSR標記在柏樹和松樹中是最有用的。方宣鈞博士實驗室利用商業(yè)化的ISSR引物進行大豆孢囊線蟲病抗性基因的遺傳分析和基因定位，獲得了與大豆孢囊線蟲病抗性基因緊密連鎖的ISSR標記，并定位在大豆的G連鎖群上。二、特異引物的PCR標記特異引物PCR標記所用的引物是針對已知序列的DNA區(qū)段而設(shè)計的，具有特定核苷酸序列，引物長度通常為18～24核苷酸，故可在常規(guī)PCR的復(fù)性溫度下進行擴增，對基因組DNA的特定序列區(qū)域進行多態(tài)性分析。根據(jù)引物序列的來源，主要可分為SSR標記、SCAR標記、STS標記及RGA標記等。（一）SSR標記SSR的基本重復(fù)單元是由幾個核苷酸組成的，重復(fù)次數(shù)一般為10～50。同一類微衛(wèi)星DNA可分布在基因組的不同位置上。由于基本單元重復(fù)次數(shù)的不同，而形成SSR座位的多態(tài)性（圖2.4）。每個SSR座位兩側(cè)一般是相對保守的單拷貝序列，因此可根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計一對特異引物來擴增SSR序列。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較擴增帶的遷移距離，就可知不同個體在某個SSR座位上的多態(tài)性。可以看出，檢測SSR標記的關(guān)鍵在于必須設(shè)計出一對特異的PCR引物，為此，必須事先了解SSR座位兩側(cè)的核苷酸序列，尋找其中的特異保守區(qū)。圖2.5是開發(fā)SSR引物序列的示意圖。其過程是，首先建立DNA文庫，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測定這些克隆的側(cè)翼序列。也可通過Genbank、EMBL和DDBJ等DNA序列數(shù)據(jù)庫搜索SSR序列，省去構(gòu)建基因文庫、雜交、測序等繁瑣的工作。但后者獲得的SSR信息量往往不如基因組文庫的多。最后，根據(jù)SSR兩側(cè)序列在同一物種內(nèi)高度保守的特性設(shè)計引物。可見，開發(fā)新的SSR引物是一項費時耗財?shù)墓ぷ鳌D2.5 SSR座位及引物序列開發(fā)示意圖SSR標記的多態(tài)性主要依賴于基本單元重復(fù)次數(shù)的變異，而這種變異在生物群體中是大量存在的。因此，SSR標記的最大優(yōu)點是具有大量的等位差異，多態(tài)性十分豐富。但是，SSR標記必須依賴測序設(shè)計引物，開發(fā)成本高。不過，目前許多物種已有現(xiàn)成的、商品化的SSR引物，對一般實驗室而言，只需利用現(xiàn)成的SSR引物進行PCR擴增，即可分析DNA的多態(tài)性。因此，一旦開發(fā)出某種生物全套的SSR引物，就獲得了最富遺傳變異信息的DNA標記。目前SSR標記已廣泛應(yīng)用于遺傳作圖和種質(zhì)鑒定等。SSR標記由于具有操作簡便和穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，似有逐漸取代RFLP標記之趨勢。（二）SCAR標記SCAR標記通常是由RAPD標記轉(zhuǎn)化而來的。為了提高所找到的某一RAPD標記在應(yīng)用上的穩(wěn)定性，可將該RAPD標記片段從凝膠上回收并進行克隆和測序，根據(jù)其堿基序列設(shè)計一對特異引物(18～24堿基左右)。也可只對該RAPD標記片段的末端進行測序，根據(jù)其末端序列，在原來RAPD所用的10堿基引物上增加相鄰的14個左右堿基，成為與原RAPD片段末端互補的特異引物。以此特異引物對基因組DNA再進行PCR擴增，便可擴增出與克隆片段同樣大小的特異帶。這種經(jīng)過轉(zhuǎn)化的特異DNA分子標記稱為SCAR標記。SCAR標記一般表現(xiàn)為擴增片段的有無，為一種顯性標記；但有時也表現(xiàn)為長度的多態(tài)性，為共顯性的標記。若待檢DNA間的差異表現(xiàn)為擴增片段的有無，可直接在PCR反應(yīng)管中加入溴化乙錠，通過在紫外燈下觀察有無熒光來判斷有無擴增產(chǎn)物，從而檢測DNA間的差異，這樣可省去電泳的步驟，使檢測變得方便、快捷、可靠，可以快速檢測大量個體。相對于RAPD標記，SCAR標記由于所用引物較長及引物序列與模板DNA完全互補，因此，可在嚴謹條件下進行擴增，結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強。隨著研究工作的發(fā)展，會有越來越多重要作物農(nóng)藝性狀的SCAR標記被開發(fā)出來，它們將在分子標記輔助育種方面發(fā)揮巨大作用。（三）STS標記STS標記是根據(jù)單拷貝的DNA片段兩端的序列，設(shè)計一對特異引物，擴增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列。STS標記采用常規(guī)PCR所用的引物長度，因此PCR分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。RFLP標記經(jīng)兩端測序，可轉(zhuǎn)化為STS標記。STS在基因組中往往只出現(xiàn)一次，從而能夠界定基因組的特異位點（Olsonetal.1989）。用STS進行物理作圖，可通過PCR或雜交途徑來完成。STS標記可作為比較遺傳圖譜和物理圖譜的共同位標，這在基因組作圖上具有非常重要的作用。（四）RGA標記迄今為止，已克隆了二十多種抗病基因，這些來自不同植物的不同抗病基因都具有一些共同的保守序列，如富含亮氨酸重復(fù)(leucine-richrepeat,LRR)、核苷酸結(jié)合位點(nucleotide-bindingsite,NBS)、絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine-threoninekinase,STK）等保守區(qū)域，即不同抗病基因具有一定的同源性。依據(jù)基因保守序列設(shè)計特異引物來擴增基因組DNA可獲得抗病基因類似物(RGA)片段。RGA既可以作為一種基于特異引物PCR的DNA標記，其本身又是潛在的（侯選的）抗病基因。許多研究結(jié)果顯示，抗病基因在染色體上有成簇排列的傾向。因此，這種RGA擴增技術(shù)是尋找抗病基因DNA標記的一種有效手段。Leister等（1996）等根據(jù)擬南芥的抗病基因Rps2和煙草的抗病基因N的高度保守的LRR序列設(shè)計引物，對馬鈴薯基因組DNA進行PCR擴增，獲得了與已知抗病基因同源、與抗線蟲病基因Gro1和抗晚疫病基因R7完全連鎖的DNA片段。Kanazin等(1996)根據(jù)來自亞麻的L6、煙草的N和擬南芥的Rps2等抗病基因的保守區(qū)域設(shè)計引物，擴增大豆DNA，至少得到9類RGA，其中一些被定位于大豆的已知抗病基因座位附近。Yu等（1996）根據(jù)煙草的N基因和擬南芥的Rps2基因共同具有的高度保守的NBS序列，合成了簡并引物，從大豆中擴增和克隆到了多個NBS序列。其中部分已定位于已知的大豆抗病毒病基因(Rpv1和Rpv2)、抗根腐病基因(Rps1、Rps2和Rps3)和抗白粉病基因(rmd)的鄰近區(qū)域。第三節(jié)基于限制性酶切和PCR的DNA標記以限制性酶切和PCR技術(shù)為基礎(chǔ)、將兩種技術(shù)有機結(jié)合的DNA標記主要有兩種，一種是先將樣品DNA用限制性內(nèi)切酶進行酶切，再對其酶切片段有選擇地進行擴增，然后檢測其多態(tài)性，這種標記稱為AFLP標記；另一種是先對樣品DNA進行?；詳U增，再用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切檢測其多態(tài)性，稱為CAPS標記。一、AFLP標記AFLP是由Zabeau等（1993）發(fā)明的一項DNA指紋技術(shù)。其基本原理是，通過對基因組DNA酶切片段的選擇性擴增來檢測DNA酶切片段長度的多態(tài)性。圖2.6為AFLP標記技術(shù)的原理示意圖。首先用兩種能產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切割成分子量大小不等的限制性片段，然后將這些片段和與其末端互補的已知序列的接頭（adapter）連接，所形成帶接頭的特異片段用作隨后的PCR反應(yīng)的模板。所用的PCR引物5’端與接頭和酶切位點序列互補，3’端在酶切位點后增加1～3個選擇性堿基，使得只有一定比例的限制性片段被選擇性地擴增，從而保證PCR反應(yīng)產(chǎn)物可經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來分辨。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點和其后的選擇性堿基的變異。AFLP擴增片段的譜帶數(shù)取決于采用的內(nèi)切酶及引物3’端選擇堿基的種類、數(shù)目和所研究基因組的復(fù)雜性。由于AFLP是限制性酶切與PCR結(jié)合的一種技術(shù)，因此具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，可以在一個反應(yīng)內(nèi)檢測大量限制性片段，一次可獲得50～100條譜帶的信息。因此，為不同來源和不同復(fù)雜程度基因組的分析提供了一個有力的工具。近年來，AFLP已大量應(yīng)用于種質(zhì)資源研究，遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位（Doninietal.1997；Keimetal.1997；Powelletal.1996）。AFLP技術(shù)的主要不足是，需要使用同位素或非同位素標記引物，相對比較費時耗財。圖2.6 AFLP標記技術(shù)的原理示意圖二、CAPS標記CAPS標記（KoniecznyandAusubel1993）是特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標記，它實際上是一些特異引物PCR標記（如SCAR和STS）的一種延伸。當(dāng)SCAR或STS的特異擴增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時，一種補救辦法就是用限制性內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性。用這種方法檢測到的DNA多態(tài)性就稱為CAPS標記。它揭示的是特異PCR產(chǎn)物DNA序列內(nèi)限制性酶切位點變異的信息，也表現(xiàn)為限制性片段長度的多態(tài)性。CAPS標記在實際研究中經(jīng)常用到。例如，Williamson等(1994)找到了一個與抗線蟲病基因Mi連鎖的顯性RAPD標記REX-1。經(jīng)克隆測序設(shè)計出20堿基特異引物，轉(zhuǎn)化為SCAR標記。但在所有抗感品系都會擴增出一條同樣大小的帶，無多態(tài)性表現(xiàn)。后用限制性內(nèi)切酶TaqⅠ酶切后，抗感品系間表現(xiàn)了多態(tài)性，并能區(qū)分純合、雜合品系，成為與Mi連鎖的共顯性標記。Caranta等（1999）獲得了辣椒中與抗馬鈴薯Y病毒病和辣椒斑駁病毒病的抗病基因Pvy4緊密連鎖的AFLP標記，將8個標記中最靠近的1個共顯性AFLP標記轉(zhuǎn)化成了共顯性的CAPS標記。第四節(jié)基于單個核苷酸多態(tài)性的DNA標記研究DNA水平上的多態(tài)性的方法很多，其中最徹底最精確的方法就是直接測定某特定區(qū)域的核苷酸序列并將其與相關(guān)基因組中對應(yīng)區(qū)域的核苷酸序列進行比較，由此可以檢測出單個核苷酸的差異。這種具有單核苷酸差異引起的遺傳多態(tài)性特征的DNA區(qū)域，可以作為一種DNA標記，即新近發(fā)展起來的單核苷酸多態(tài)性（SNP）標記。SNP在大多數(shù)基因組中存在較高的頻率，在人類基因組中平均每1.3kb就有一個SNP存在。這種類型的DNA多態(tài)性僅有兩個等位基因的差異，所以SNP的最大的雜合度為50%。盡管單一的SNP所提供的信息量遠小于現(xiàn)在常用的遺傳標記，但是SNP數(shù)量豐富，可以進行自動化檢測，因此，SNP具有廣泛的應(yīng)用前景。鑒定SNP標記的主要途徑有二條：（1）在DNA測序過程中，利用堿基的峰高和面積的變化來監(jiān)測單個核苷酸的改變引起的DNA多態(tài)性；（2）通過對已有DNA序列進行分析比較來鑒定SNP標記。不過最直接的方法還是通過設(shè)計特異的PCR引物擴增某個特定區(qū)域的DNA片段，通過測序和遺傳特征的比較，來鑒定該DNA片段是否可以作為SNP標記。大規(guī)模的SNP鑒定則要借助于DNA芯片技術(shù)。DNA芯片技術(shù)主要是分子生物學(xué)和微細加工技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，這項技術(shù)實現(xiàn)了DNA分析的高通量、微型化和自動化。一塊很小的DNA芯片可固定幾萬、甚至幾十萬個不同的DNA探針，通過完全自動化的設(shè)備對其進行分析，可以快速、靈敏和平行地對大量（乃至全基因組）的基因進行同步檢測。利用芯片技術(shù)進行SNP標記的篩選鑒定已有成功的例子。Wang（1998）利用DNA芯片技術(shù)對人類基因組的2.3MbDNA進行檢測，鑒別出3241個侯選的SNP，并將其中的2227個SNP定位到了遺傳圖譜中。這一結(jié)果在核苷酸水平上為人類遺傳多樣性提供了重要數(shù)據(jù)，為大規(guī)模鑒定人類SNP提供了可行的方法。利用SNP標記已發(fā)現(xiàn)與人類一些重要疾病（哮喘病、糖尿病、精神分裂癥、癌癥、鐮刀貧血癥、血友病等）相連鎖的標記座位（RischandMerikangas1996；Collinsetal.1997）。盡管SNP標記已成為人類遺傳研究的有力工具，但迄今尚無關(guān)于SNP標記在植物遺傳與育種中應(yīng)用的研究報導(dǎo)。專門通過大規(guī)模測序去尋找植物基因組中SNP標記的成本太高，但DNA芯片技術(shù)對基因組已經(jīng)測序的植物以及利用基因庫中的大量DNA序列信息進行SNP鑒定是非常有意義的。隨著擬南芥、水稻等重要植物的全基因組測序的完成，SNP標記必將成為植物遺傳與育種研究中的理想的遺傳標記。第三章分子圖譜的構(gòu)建檢測出的每個分子標記反映的都是相應(yīng)染色體座位上的遺傳多態(tài)性狀態(tài)。為了有效地分析利用分子標記所提供的遺傳信息，人們希望知道不同分子標記在染色體上的相對位置或排列情況，也就是要構(gòu)建分子標記的遺傳連鎖圖譜。利用DNA標記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜在原理上與傳統(tǒng)遺傳圖譜的構(gòu)建是一樣的。其基本步驟包括：選擇適合作圖的DNA標記；根據(jù)遺傳材料之間的DNA多態(tài)性，選擇用于建立作圖群體的親本組合；建立具有大量DNA標記處于分離狀態(tài)的分離群體或衍生系；測定作圖群體中不同個體或株系的標記基因型；對標記基因型數(shù)據(jù)進行連鎖分析，構(gòu)建標記連鎖圖。至今為止，已構(gòu)建了許多植物的高密度分子標記連鎖圖。本章側(cè)重介紹利用DNA標記構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜的原理與方法。第一節(jié)作圖群體的建立要構(gòu)建DNA標記連鎖圖譜，必須建立作圖群體。建立作圖群體需要考慮的重要因素包括親本的選配、分離群體類型的選擇及群體大小的確定等。一、親本的選配親本的選擇直接影響到構(gòu)建連鎖圖譜的難易程度及所建圖譜的適用范圍。一般應(yīng)從四個方面對親本進行選擇，首先要考慮親本間的DNA多態(tài)性。親本之間的DNA多態(tài)性與其親緣關(guān)系有著密切關(guān)系，這種親緣關(guān)系可用地理的、形態(tài)的或同工酶多態(tài)性作為選擇標準。一般而言，異交作物的多態(tài)性高，自交作物的多態(tài)性低。例如，玉米的多態(tài)性極好，一般自交系間配制的群體就可成為理想的RFLP作圖群體；番茄的多態(tài)性較差，因而只能選用不同種間的后代構(gòu)建作圖群體；水稻的多態(tài)性居中，美國康乃爾大學(xué)S.D.Tanksley實驗室1988年發(fā)表的RFLP連鎖圖譜是以秈稻和爪哇稻之間的雜交組合為基礎(chǔ)構(gòu)建的（McCouchetal.1988）。在作物育種實踐中，育種家常將野生種的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)育到栽培種中，這種親源關(guān)系較遠的雜交轉(zhuǎn)育，DNA多態(tài)性非常豐富。第二，選擇親本時應(yīng)盡量選用純度高的材料，并進一步通過自交進行純化。第三，要考慮雜交后代的可育性。親本間的差異過大，雜種染色體之間的配對和重組會受到抑制，導(dǎo)致連鎖座位間的重組率偏低，并導(dǎo)致嚴重的偏分離現(xiàn)象，降低所建圖譜的可信度和適用范圍；嚴重的還會降低雜種后代的結(jié)實率，甚至導(dǎo)致不育，影響分離群體的構(gòu)建。由于各種原因，僅用一對親本的分離群體建立的遺傳圖譜往往不能完全滿足基因組研究和各種育種目標的要求，應(yīng)選用幾個不同的親本組合，分別進行連鎖作圖，以達到相互彌補的目的。第四，選配親本時還應(yīng)對親本及其F1雜種進行細胞學(xué)鑒定。若雙親間存在相互易位，或多倍體材料（如小麥）存在單體或部分染色體缺失等問題，那末其后代就不宜用來構(gòu)建連鎖圖譜。二、分離群體類型的選擇根據(jù)其遺傳穩(wěn)定性可將分離群體分成兩大類：一類稱為暫時性分離群體，如F2、F3、F4、BC、三交群體等，這類群體中分離單位是個體，一經(jīng)自交或近交其遺傳組成就會發(fā)生變化，無法永久使用。另一類稱為永久性分離群體，如RI、DH群體等，這類群體中分離單位是株系，不同株系之間存在基因型的差異，而株系內(nèi)個體間的基因型是相同且純合的，是自交不分離的。這類群體可通過自交或近交繁殖后代，而不會改變?nèi)后w的遺傳組成，可以永久使用。構(gòu)建DNA連鎖圖譜可以選用不同類型的分離群體，它們各有其優(yōu)缺點，因此應(yīng)結(jié)合具體情況選用。（一）F2代群體F2群體是常用的作圖群體，迄今大多數(shù)植物的DNA標記連鎖圖譜都是用F2群體構(gòu)建的。不論是自花授粉植物，還是異花授粉植物，建立F2群體都是容易的，這是使用F2群體進行遺傳作圖的最大優(yōu)點。但F2群體的一個不足之處是存在雜合基因型。對于顯性標記，將無法識別顯性純合基因型和雜合基因型。由于這種基因型信息簡并現(xiàn)象的存在，會降低作圖的精度。而為了提高精度，減小誤差，則必須使用較大的群體，從而會增加DNA標記分析的費用。F2群體的另一個缺點是不易長期保存，有性繁殖一代后，群體的遺傳結(jié)構(gòu)就會發(fā)生變化。為了延長F2群體的使用時間，一種方法是對其進行無性繁殖，如進行組織培養(yǎng)擴繁。但這種方法不是所有的植物都適用，且耗資費工。另一種方法是使用F2單株的衍生系（F3株系或F4家系）。將衍生系內(nèi)多個單株混合提取DNA，則能代表原F2單株的DNA組成。為了保證這種代表性的真實可靠，衍生系中選取的單株必須是隨機的，且數(shù)量要足夠多。這種方法對于那些繁殖系數(shù)較大的自花授粉植物（如水稻、小麥等）特別適用。（二）BC1群體BC1（回交一代）也是一種常用的作圖群體。BC1群體中每一分離的基因座只有兩種基因型，它直接反映了F1代配子的分離比例，因而BC1群體的作圖效率最高，這是它優(yōu)于F2群體的地方。BC1群體還有一個用途，就是可以用來檢驗雌、雄配子在基因間的重組率上是否存在差異。其方法是比較正、反回交群體中基因的重組率是否不同。例如正回交群體為（A×B）×A，反回交群體為A×（A×B），則前者反映的是雌配子中的重組率，后者反映的是雄配子中的重組率。雖然BC1群體是一種很好的作圖群體，但它也與F2群體一樣，存在不能長期保存的問題。可以用F2中使用的類似方法來延長BC1群體的使用時間。另外，對于一些人工雜交比較困難的植物，BC1群體也不太合適，因為一是難以建立較大的BC1群體，二是容易出現(xiàn)假雜種，造成作圖的誤差。順便一提，對于一些自交不親和的材料，可以使用三交群體，即（A×B）×C。由于存在自交不親和性，這樣的三交群體中不存在假雜種現(xiàn)象。（三）RI群體RI（重組自交系）群體是雜種后代經(jīng)過多代自交而產(chǎn)生的一種作圖群體，通常從F2代開始，采用單粒傳的方法來建立。由于自交的作用是使基因型純合化，因此，RI群體中每個株系都是純合的，因而RI群體是一種可以長期使用的永久性分離群體。理論上，建立一個無限大的RI群體，必須自交無窮多代才能達到完全純合；建立一個有限大小的RI群體則只需自交有限代。然而，即使是建立一個通常使用的包含100~200個株系的RI群體，要達到完全純合，所需的自交代數(shù)也是相當(dāng)多的。據(jù)吳為人等（1997）從理論上推算，對一個擁有10條染色體的植物種，要建立完全純合的RI作圖群體，至少需要自交15代?？梢姡I群體是非常費時的。在實際研究中，人們往往無法花費那么多時間來建立一個真正的RI群體，所以常常使用自交6~7代的“準”RI群體。從理論上推算，自交6代后，單個基因座的雜合率只有大約3%，已基本接近純合。然而，由于構(gòu)建連鎖圖譜時涉及到大量的DNA標記座位，因而雖然多數(shù)標記座位已達到或接近完全純合，但仍有一些標記座位存在較高的雜合率，有的高達20%以上（李維明等2000）。盡管如此，實踐證明，利用這樣的“準”RI群體來構(gòu)建分子標記連鎖圖譜仍是可行的。在RI群體中，每一分離座位上只存在兩種基因型，且比例為1:1。從這點看，RI群體的遺傳結(jié)構(gòu)與BC1相似，也反映了F1配子的分離比例。但值得注意的是，當(dāng)分析RI群體中兩個標記座位之間的連鎖關(guān)系時，算得的重組率比例并不等于F1配子中的重組率，這是因為在建立RI群體的過程中，兩標記座位間每一代都會發(fā)生重組，所以RI群體中得到的重組率比例是多代重組頻率的積累。不過，從理論上可以推算出，RI群體中的重組比例（R）與F1配子中的重組率（r）之間的關(guān)系為：R=2r/(1+2r)。因此，用RI群體仍然可以估計重組率，亦即RI群體仍然可以用于遺傳作圖。RI群體的優(yōu)點是可以長期使用，可以進行重復(fù)試驗。因此它除了可用于構(gòu)建分子標記連鎖圖外，特別適合于數(shù)量性狀基因座（QTL）的定位研究。但是，考慮到構(gòu)建RI群體要花費很長時間，如果僅是為了構(gòu)建分子標記連鎖圖的話，選用RI群體是不明智的。另外，異花授粉植物由于存在自交衰退和不結(jié)實現(xiàn)象，建立RI群體也比較困難。（四）DH群體高等植物的單倍體（Haploid）是含有配子染色體數(shù)的個體。單倍體經(jīng)過染色體加倍形成的二倍體稱為加倍單倍體或雙單倍體（DH）。DH群體產(chǎn)生的途徑很多，亦因物種不同而異，最常見的方法是通過花藥培養(yǎng)，即取F1植株的花藥進行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，然后對染色體進行加倍產(chǎn)生DH植株。DH植株是純合的，自交后即產(chǎn)生純系，因此DH群體可以穩(wěn)定繁殖，長期使用，是一種永久性群體。DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)直接反映了F1配子中基因的分離和重組，因此DH群體與BC1群體一樣，作圖效率是最高的。另外，由于DH群體跟RI群體一樣，可以反復(fù)使用，重復(fù)試驗，因此也特別適合于QTL定位的研究。DH群體直接從F1花粉經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生，因而建立DH群體所需時間不多。但是，產(chǎn)生DH植株有賴于花培技術(shù)。有些植物的花藥培養(yǎng)非常困難，就無法通過花培來建立DH群體。另外，植物的花培能力跟基因型關(guān)系較大，因而花培過程會對不同基因型的花粉產(chǎn)生選擇效應(yīng)，從而破壞DH群體的遺傳結(jié)構(gòu)，造成較嚴重的偏分離現(xiàn)象，這會影響遺傳作圖的準確性。因此，如果是以構(gòu)建分子標記連鎖圖為主要目的的話，DH群體不是一種理想的作圖群體。三、群體大小的確定遺傳圖譜的分辨率和精度，很大程度上取決于群體大小。群體越大，則作圖精度越高。但群體太大，不僅增大實驗工作量，而且增加費用。因此確定合適的群體大小是十分必要的。合適群體大小的確定與作圖的內(nèi)容有關(guān)。大量的作圖實踐表明，構(gòu)建DNA標記連鎖圖譜所需的群體遠比構(gòu)建形態(tài)性狀特別是數(shù)量性狀的遺傳圖譜要小，大部分已發(fā)表的分子標記連鎖圖譜所用的分離群體一般都不足100個單株或家系。而如果用這樣大小的群體去定位那些控制農(nóng)藝性狀尤其是數(shù)量性狀的基因，就會產(chǎn)生很大的試驗誤差。從作圖效率考慮，作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個方面：一是從隨機分離結(jié)果可以辨別的最大圖距，二是兩個標記間可以檢測到重組的最小圖距。因此，作圖群體的大小可根據(jù)研究的目標來確定。作圖群體越大，則可以分辨的最小圖距就越小，而可以確定的最大圖距也越大。如果建圖的目的是用于基因組的序列分析或基因分離等工作，則需用較大的群體，以保證所建連鎖圖譜的精確性。在實際工作中，構(gòu)建分子標記骨架連鎖圖可基于大群體中的一個隨機小群體（如150個單株或家系），當(dāng)需要精細地研究某個連鎖區(qū)域時，再有針對性地在骨架連鎖圖的基礎(chǔ)上擴大群體。這種大小群體相結(jié)合的方法，既可達到研究的目的，又可減輕工作量。作圖群體大小還取決于所用群體的類型。如常用的F2和BC1兩種群體，前者所需的群體就必須大些。這是因為，F(xiàn)2群體中存在更多種類的基因型，而為了保證每種基因型都有可能出現(xiàn)，就必須有較大的群體。一般而言，F(xiàn)2群體的大小必須比BC1群體大約大一倍，才能達到與BC1相當(dāng)?shù)淖鲌D精度。所以說，BC1的作圖效率比F2高得多。在分子標記連鎖圖的構(gòu)建中，DH群體的作圖效率在統(tǒng)計上與BC1相當(dāng)，而RI群體則稍差些。總的說來，在分子標記連鎖圖的構(gòu)建方面，為了達到彼此相當(dāng)?shù)淖鲌D精度，所需的群體大小的順序為F2>RI>BC1和DH。第二節(jié)DNA標記分離數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)處理一、分離數(shù)據(jù)的收集與數(shù)字化從分離群體中收集分子標記的分離數(shù)據(jù)，獲得不同個體的DNA多態(tài)性信息，是進行遺傳連鎖分析的第一步。通常各種DNA標記基因型的表現(xiàn)形式是電泳帶型，將電泳帶型數(shù)字化是DNA標記分離數(shù)據(jù)進行數(shù)學(xué)處理的關(guān)鍵。下面以RFLP為例來說明將DNA標記帶型數(shù)字化的方法。假設(shè)某個RFLP座位在兩個親本（P1,P2）中各顯示一條帶，由于RFLP是共顯性的，則F1個體中將表現(xiàn)出兩條帶，而F2群體中不同個體的帶型有三種，即P1型、P2型和F1（雜合體）型?？梢愿鶕?jù)習(xí)慣或研究人員的喜好，任意選擇一組數(shù)字或符號，來記錄F2個體的帶型。例如，將P1帶型記為1，P2帶型記為3，F(xiàn)1帶型記為2。如果帶型模糊不清或由于其它原因使數(shù)據(jù)缺失，則可記為0。假設(shè)全部試驗共有120個F2單株，檢測了100個RFLP標記，這樣可得到一個由100（行）×120（列）的、由簡單數(shù)字組成的RFLP數(shù)據(jù)矩陣。進行DNA標記帶型數(shù)字化的基本原則是，必須區(qū)分所有可能的類型和情況，并賦與相應(yīng)的數(shù)字或符號。比如在上例中，總共有4種類型，即P1型、F1型、P2型和缺失數(shù)據(jù)，故可用4個數(shù)字1、2、3和0分別表示之。如果存在顯性標記，則F2中還會出現(xiàn)兩種情況。一種是P1對P2顯性，于是P1型和F1型無法區(qū)分，這時應(yīng)將P1型和F1型作為一種類型，記為4。另一種情況正好相反，P2對P1顯性，無法區(qū)分P2型和F1型，故應(yīng)將它們合為一種類型，記為5。對于BC1、DH和RI群體，每個分離的基因座都只有兩種基因型，不論是共顯性標記還是顯性標記，兩種基因型都可以識別，加上缺失數(shù)據(jù)的情況，總共只有3種類型。因而用3個數(shù)字就可以將標記全部帶型數(shù)字化。在分析質(zhì)量性狀基因與遺傳標記之間的連鎖關(guān)系時，也必須將有關(guān)的表型數(shù)字化，其方法與標記帶型的數(shù)字化相似。例如，假設(shè)在DH群體中，有一個主基因控制株高，那么就可以將株系按植株的高度分為高稈和矮稈兩大類，然后根據(jù)親本的表現(xiàn)分別給高稈和矮稈株系賦值，如1和2。將質(zhì)量性狀經(jīng)過這樣的數(shù)字化處理，就可以與DNA標記數(shù)據(jù)放在一起進行連鎖分析。DNA標記數(shù)據(jù)的收集和處理應(yīng)注意以下問題：（1）應(yīng)避免利用沒有把握的數(shù)據(jù)。由于分子多態(tài)性分析涉及許多實驗步驟，很難避免出現(xiàn)錯誤，經(jīng)常會遇到所得試驗結(jié)果（如X-光片）不清楚等問題。如果硬性地利用這樣沒有把握的數(shù)據(jù)，不僅會嚴重影響該標記自身的定位，而且還會影響到其它標記的定位。因此，應(yīng)刪除沒有把握的數(shù)據(jù)，寧可將其作為缺失數(shù)據(jù)處理，或重做試驗。（2）應(yīng)注意親本基因型，對親本基因型的賦值（如P1型為1，P2型為2），在所有的標記座位上必須統(tǒng)一，千萬別混淆。如果已知某兩個座位是連鎖的，而所得結(jié)果表明二者是獨立分配的，這就有可能是把親本類型弄錯引起的。（3）當(dāng)兩親本出現(xiàn)多條帶的差異時，應(yīng)通過共分離分析鑒別這些帶是屬于同一座位還是分別屬于不同座位。如屬于不同座位，應(yīng)逐帶記錄分離數(shù)據(jù)。二、遺傳圖距與物理距離對應(yīng)關(guān)系的估計不同生物的1cM圖距所對應(yīng)的實際物理距離（堿基對數(shù)量）存在很大差異。一般而言，生物越低等或越簡單，1cM圖距平均對應(yīng)的堿基對數(shù)量就越少（表3.1）。表3.1中給出的各種生物中遺傳圖距與物理距離之間的對應(yīng)關(guān)系只是一個大約的平均值，實際上它變化很大。在一條染色體上，由于不同區(qū)域上發(fā)生交換的頻率存在差異，因而遺傳圖距與物理距離之間的對應(yīng)關(guān)系可以有很大的變化。例如，在著絲粒附近，染色體交換受到抑制，因而所估計的遺傳圖距小于平均對應(yīng)的物理距離。在同一種生物中，兩個特定基因座之間的遺傳圖距會因遺傳背景的不同而改變，甚至有時由同一對親本所產(chǎn)生的遺傳背景相同的不同群體間也存在很大差異。表3.1 不同生物中單位圖距所相當(dāng)?shù)钠骄锢砭嚯x物種基因組大?。╧b）遺傳圖距（cM）kb/cM嗜菌體T41.6×1028000.2大腸桿菌4.2×1031,7502.4酵母2.0×1044,2004.8真菌2.7×1041,00027.0線蟲8.0×104320250.0果蠅1.4×105280500.0水稻4.5×1051,500300.0小鼠3.0×1061,7001,800.0人類3.3×1063,3001,000.0玉米2.5×1062,5001,000.0三、構(gòu)建DNA標記圖譜的計算機軟件遺傳圖譜的構(gòu)建需要對大量標記之間的連鎖關(guān)系進行統(tǒng)計分析。隨著標記數(shù)目的增加，計算工作量常常呈指數(shù)形式增加，這是手工無法完成的。因此，必須借助計算機進行分析和處理。許多學(xué)者為構(gòu)建遺傳圖譜設(shè)計了專用程序包,通過Internet網(wǎng)址/soft/list.html可以獲得各種專用程序的相關(guān)信息，如軟件的名稱及簡要介紹，源程序編碼語言、支持的操作系統(tǒng)、執(zhí)行程序的名稱、參考文獻以及獲取軟件的網(wǎng)址等。應(yīng)用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構(gòu)建的常用軟件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE軟件可通過ftp:///software/linkage獲得，該軟件是利用最大似然法估計兩座位或多座位間的重組率和LOD值；MAPMAKER/EXP可通過ftp:///distri-bution/software/mapmaker3獲得，該軟件可以應(yīng)用于各種類型的實驗群體進行遺傳作圖，是目前應(yīng)用最為廣泛的作圖軟件之一。第三節(jié)DNA標記連鎖圖譜的完善一、DNA標記連鎖群的染色體定位把分子標記所建立的連鎖群與經(jīng)典遺傳圖譜聯(lián)系起來，并將其歸屬到相應(yīng)的染色體上，是構(gòu)建了一個比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作。通常根據(jù)分子標記與已知染色體位置的形態(tài)標記的連鎖關(guān)系來確定分子標記連鎖群屬于哪條染色體。還可以利用非整倍體或染色體結(jié)構(gòu)變異材料，如水稻中利用三體、玉米中利用A/B易位系、小麥中利用缺體/四體染色體代換系等，將分子標記連鎖群歸屬到相應(yīng)的染色體上。以水稻為例，目前已獲得全套12條染色體的初級三體（2n+1）。在水稻某種三體中，由于三體染色體有一式3份，其DNA含量為其它11條染色體的1.5倍。在DNA定量相當(dāng)準確的條件下，用已知能檢測某一連鎖群的探針分別與12種三體的總DNA雜交。根據(jù)劑量效應(yīng)，雜交強弱與同源序列的含量成正比，雜交后對應(yīng)三體的DNA濾膜放射自顯影顯帶強度將明顯高于其它11種，由此可以判定該標記所對應(yīng)的序列就在該三體染色體上。隨著技術(shù)的進步，原位分子雜交的靈敏度已可以揭示單拷貝序列的雜交位點，因此采用原位分子雜交可以容易地將連鎖群的分子標記定位到染色體上。要得到一個完整的遺傳圖譜，必須知道染色體上的標記與著絲粒之間的距離。一個完整的染色體具有以下幾個主要部分：著絲粒、縊痕、隨體及端粒，這些基本結(jié)構(gòu)在生物染色體的運動與復(fù)制等方面起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)也是遺傳圖譜制作中不可忽視的重要部分。由于著絲粒并不是一個基因，不能從表型測知，因此采用常規(guī)的兩點、三點乃至多點分析方法是無法確定標記與著絲粒之間的關(guān)系的。在經(jīng)典遺傳圖譜的構(gòu)建中，一般采用近端著絲粒染色體來對基因與著絲之間的距離進行定位。近端著絲粒染色體是正常染色體在著絲粒附近斷裂形成的異常染色體。目前已獲得小麥全部42條染色體的近端著絲粒染色體。利用染色體易位材料也可以判斷著絲粒在染色體上的位置。一般易位點和著絲粒所在部分的交換被抑制，因而推算位于著絲粒兩旁的易位點與標記基因間的重組率時一般都偏小。利用這個現(xiàn)象可以推算連鎖圖上著絲粒的位置。在細胞學(xué)上，利用已知易位點的易位系統(tǒng)進行基因分析也可知道著絲粒的位置。早在1945年，在玉米中就利用易位分析的結(jié)果推測了全部染色體的著絲粒位置。染色體上的端粒是指染色體的自然末端。在遺傳圖譜的構(gòu)建中，端粒位置的確定就意味著為染色體的全長設(shè)定界標。傳統(tǒng)的凝膠電泳方法由于分辨能力有限，大多數(shù)情況下無法將具有多態(tài)性的端粒片段區(qū)分開來。一般要借助具有高分辨率的脈沖場凝膠電泳（PFGE）才能將有差異的端粒片段分離開來。利用PFGE與切割位點稀少的限制性酶相結(jié)合，Wu和Tanksley（1993）研究了水稻端粒結(jié)構(gòu)的特征，采用來自擬南芥的端粒探針，將三個水稻的端粒DNA電泳條帶分別定位在第8、9、11染色體上，并證實了多態(tài)性的端粒片段不僅在遺傳上而且在物理上與遺傳圖譜上最遠端的RFLP標記相連鎖。目前，在日本水稻基因組研究計劃所構(gòu)建的包含2275個標記的水稻分子連鎖圖中，除第9染色體之外，其余11條染色體的著絲粒（區(qū)）都已定位（Harushimaetal.1998）。另外，該圖中的第5染色體短臂、第11染色體兩臂以及第12染色體短臂的端粒也已定位。二、飽和DNA標記連鎖圖的制作遺傳圖譜飽和度是指單位長度染色體上已定位的標記數(shù)或標記在染色體上的密度。一個基本的染色體連鎖框架圖大概要求在染色體上的標記平均間隔不大于20cM。如果構(gòu)建連鎖圖譜的目的是為了進行主基因的定位，其平均間隔要求在10～20cM或更小。用于QTL定位的連鎖圖，其標記的平均間隔要求在10cM以下。如果構(gòu)建的連鎖圖譜是為了進行基因克隆，則要求目標區(qū)域標記的平均間隔在1cM以下。不同生物基因組大小有極大差異，因此滿足上述要求所需的標記數(shù)是不同的。以人類和水稻為例，它們的基因組全長分別為3.3×106kb和4.5×105kb，如果構(gòu)建一個平均圖距為0.5cM的分子圖譜,則所要定位的標記數(shù)就要分別達到6600和3000個。幾種生物不同圖譜飽和度下所需定位的標記數(shù)如表3.2所示。表3.2遺傳圖譜達到特定飽和度所需的標記數(shù)生物人類水稻玉米擬南芥番茄基因組大小(kb)(cM)kb/cM3.3×106330010004.5×10515003002.5×106250010007.0×1045001407.1×1051500473圖譜飽和度20cM10cM5cM1cM0.5cM16533066033006600751503001