羊下丘腦中催產(chǎn)素的分布和表達(dá)

腦癱不僅是一個(gè)整合內(nèi)臟活動(dòng)的中心，也是一個(gè)調(diào)節(jié)顱內(nèi)系統(tǒng)的中心。動(dòng)物的生殖過程受體內(nèi)外多種因素的綜合調(diào)控,其中起主要調(diào)控作用的是下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng),即下丘腦通過分泌神經(jīng)肽或細(xì)胞因子對生殖腺進(jìn)行直接或間接的調(diào)控,從而控制動(dòng)物的生殖活動(dòng)。催產(chǎn)素(oxytocin,OT)是下丘腦特殊分化的神經(jīng)細(xì)胞合成的九肽,具有多種功能,其中在生殖方面具有促進(jìn)子宮收縮、乳腺排乳,卵泡發(fā)育和排卵,黃體形成和溶解以及調(diào)節(jié)發(fā)情周期等重要作用。在下丘腦OT定位上,對倉鼠、大鼠、人、奶山羊和樹鼩的研究結(jié)果表明,合成OT的部位已由傳統(tǒng)概念的室旁核(PVN)和視上核(SON)擴(kuò)大到下丘腦的較多區(qū)域。上述報(bào)道均是研究了某種動(dòng)物某一生理階段OT的分布,尚未見到對OT在不同生殖周期奶山羊下丘腦分布的系統(tǒng)研究。因此,在研究了羔羊期、青年期、妊娠期奶山羊的基礎(chǔ)上,筆者在本試驗(yàn)中采用特異性強(qiáng)、靈敏度高的免疫組化鏈霉素抗生物蛋白-過氧化物酶(Streptavidin-peroxidase,SP)法與原位雜交法相結(jié)合,對2歲齡的成年發(fā)情期奶山羊下丘腦中OT及OTmRNA的神經(jīng)元的分布進(jìn)行了研究,為進(jìn)一步研究OT生理功能、調(diào)控機(jī)理及其類似物在繁殖生產(chǎn)和臨床治療上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。1材料和方法1.1多聚甲醛磷酸緩沖液的制備2歲發(fā)情期關(guān)中奶山羊4只,臨床健康,西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。對山羊頸總動(dòng)脈放血致死,迅速取下頭部,向頸總動(dòng)脈灌注37℃生理鹽水沖凈血液后再灌注4℃的40g/L多聚甲醛磷酸緩沖液,灌注先快后慢。取下丘腦后放入40g/L多聚甲醛磷酸緩沖液后固定10～12h,再放入含200g/L蔗糖的磷酸緩沖液中,直至組織沉底。1.2第四軍醫(yī)大學(xué)抗鼠鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化超敏SP試劑盒:福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品;鼠抗OT單克隆抗體:第四軍醫(yī)大學(xué)饋贈(zèng),工作濃度為1∶5000;牛血清白蛋白:華美生物工程公司產(chǎn)品。OT原位雜交試劑盒和原位雜交用蓋玻片購自武漢博士德公司。焦碳酸二乙脂(Diethylpyrocarbonate,DEPC)購自西安生物有限公司。葡萄糖氧化酶和四鹽酸3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB):Sigma公司生產(chǎn),華美生物工程公司分裝。1.3切片的制備對下丘腦做連續(xù)冠狀切片,片厚20μm,切片分為4套:一套用于OT原位雜交,一套用于OT免疫組織化學(xué)染色,一套用于尼氏染色,一套用作陰性對照。1.4免疫組織化學(xué)和原階段異交染色程序1.4.1免疫法提取抗菌素切片經(jīng)0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;在室溫下用過氧化物酶阻斷液(試劑A)孵育40min;用0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min,放入非免疫動(dòng)物血清(試劑B)中,室溫下孵育40min;再放入第一抗體中,室溫孵育24～48h。0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;加生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C),室溫下孵育1.5h;用0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;加鏈親合素-過氧化物酶溶液(試劑D),室溫下孵育1.5h,0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min,放入DAB顯色液中呈色:硫酸鎳胺醋酸緩沖液50mL,DAB0.03g用雙蒸水50mL溶解過濾,兩液混合,加入葡萄糖0.2g,氯化銨0.04g,最后加入葡萄糖氧化酶0.001g,呈色時(shí)間不超過30min,其間在鏡下觀察、掌握呈色時(shí)間。蒸餾水終止反應(yīng)后,洗2次,PBS液洗2次,每次15s后進(jìn)行貼片,晾干,酒精脫水、二甲苯透明,加拿大中性樹膠封片。1.4.2高效液相色譜法切片經(jīng)40g/L多聚甲醛磷酸緩沖液(含1/1000的DEPC)室溫固定20～30min后,用蒸餾水充分洗滌。切片上滴加1份300mL/L的H2O2和50份甲醇的混合液,處理30min后用蒸餾水洗滌3次。切片上滴加30g/L檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫消化5～120s,用原位雜交專用PBS洗3次,每次5min,蒸餾水洗1次。再滴加10g/L多聚甲醛磷酸緩沖液(含1/1000的DEPC)固定10min,蒸餾水洗3次。每張切片滴加20μL預(yù)雜交液放入濕盒,在恒溫箱38～42℃作用2～4h后吸取多余的液體。每張切片滴加20μL雜交液,蓋上專用蓋玻片并于38～42℃雜交過夜。揭掉蓋玻片,用37℃左右水溫的2×SSC洗滌2次,每次5min,0.5×SSC洗滌1次15min,0.2×SSC洗滌1次15min。滴加封閉液在37℃孵育30min后甩去多余液體,滴加生物素化鼠抗地高辛孵育1h后,用原位雜交專用PBS洗3次,每次5min。滴加生物素化過氧化酶孵育30min后用原位雜交專用PBS洗4次,每次5min,入DAB顯色液呈色:硫酸鎳胺醋酸緩沖液50mL,DAB0.03g用雙蒸水50mL溶解過濾,兩液混合,加入葡萄糖0.2g,氯化銨0.04g,最后加入葡萄糖氧化酶0.001g,呈色時(shí)間不超過30min。蒸餾水終止反應(yīng)后,洗2次;PBS液洗2次,每次15s,酒精脫水、二甲苯透明,加拿大中性樹膠封片。陰性對照試驗(yàn)以PBS液(pH7.4)替代雜交液,其他步驟同上。1.5陽性產(chǎn)物的檢測將制得的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄,Motic數(shù)碼顯微鏡拍照,用江蘇捷達(dá)801形態(tài)分析軟件對陽性產(chǎn)物進(jìn)行分析,每組動(dòng)物每個(gè)部位隨機(jī)選取5張切片,測量陽性細(xì)胞的數(shù)目(以具有細(xì)胞核的細(xì)胞為準(zhǔn))、大小及平均灰度值。2結(jié)果2.1陰性反應(yīng)及神經(jīng)纖維OT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈深淺不等的藍(lán)黑色,多為雙極神經(jīng)元或多極神經(jīng)元,也見單極神經(jīng)元;胞體呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等,大小不等,成堆或分散分布。背景無色或淺藍(lán)色,反差明顯,對照試驗(yàn)均呈陰性反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)顆粒著色的深淺可分為強(qiáng)陽性、中等陽性和弱陽性3種。強(qiáng)陽性細(xì)胞藍(lán)黑色,胞體內(nèi)深藍(lán)色顆粒融合成團(tuán),如視上核(圖1-A),室旁核(圖1-B);弱陽性細(xì)胞著色淺淡,輪廓不清;中等陽性細(xì)胞介于二者之間,如結(jié)節(jié)乳頭體核、下丘腦外側(cè)區(qū)。OT陽性神經(jīng)元的突起伸向第三腦室或血管(圖1-C),免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維在第三腦室,正中隆起、視上彌散核等有較多分布(圖1-D)。OT陽性細(xì)胞在下丘腦分布廣泛,在19個(gè)核團(tuán)(區(qū))中具有陽性表達(dá),在視上核、室旁核、乳頭體內(nèi)側(cè)核、乳頭體后核和下丘腦外側(cè)區(qū)等分布較多,而在視上彌散核、視前交叉上核、乳頭體上核及前聯(lián)合核分布較少。2.2ot基因的表型含有OTmRNA陽性雜交信號(hào)的細(xì)胞呈藍(lán)黑色,背景不著色或淺藍(lán)色,對照組切片均為陰性。下丘腦的各個(gè)核團(tuán)均呈較強(qiáng)的雜交信號(hào),與OT免疫陽性產(chǎn)物基本一致,如視上核(圖1-E)、室旁核(圖1-F);與免疫組化相比,雜交的陽性細(xì)胞呈橢圓形、三角形、梭形等,但突起較少,形狀以橢圓形為主。OTmRNA廣泛分布在下丘腦的23個(gè)核團(tuán)(區(qū))中,在下丘腦的視上核、室旁核、腹內(nèi)側(cè)核、乳頭體內(nèi)側(cè)核和乳頭體外側(cè)核分布較多,而在乳頭體上核、結(jié)節(jié)乳頭體核、乳頭體前外側(cè)核、后穹窿周核等分布較少。原位雜交尚未發(fā)現(xiàn)有OTmRNA的陽性神經(jīng)纖維。2.3前腦后側(cè)核和前腦內(nèi)核分布下丘腦內(nèi)OT及其OTmRNA細(xì)胞數(shù)在15個(gè)核團(tuán)(區(qū))中具有共同分布(見圖2),還觀察到陽性產(chǎn)物多存在于視上核、室旁核。其次在乳頭體內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)區(qū)也有較多細(xì)胞分布,在視前交叉上核、前聯(lián)合核、視前內(nèi)側(cè)核和視前外側(cè)核沒有OTmRNA分布,而背內(nèi)側(cè)核、下丘腦前區(qū)、室周核等8個(gè)核團(tuán)(區(qū))無OT陽性細(xì)胞分布。由下丘腦內(nèi)OT及其OTmRNA灰度值在各個(gè)核團(tuán)中的分布(見圖3),可觀察到在視上核、室旁核的灰度值較低,其次在交叉上核、乳頭體內(nèi)側(cè)核、視上彌散核、結(jié)節(jié)乳頭體核等核團(tuán)也較低。3奶山羊金屬核團(tuán)中ot的表達(dá)已有的關(guān)于OT生理功能方面的研究表明,OT除在生殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用外,對心血管功能、消化功能、體液滲透壓、神經(jīng)免疫也有調(diào)節(jié)作用,與應(yīng)激反應(yīng)、睡眠與覺醒、痛覺調(diào)制等有密切關(guān)系,并能改善母親期長期空間記憶,增加人類之間的信任感,對精神失調(diào)和社會(huì)行為的破壞如自閉癥有改善作用。生理功能的產(chǎn)生必定有其形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),OT合成部位的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Monika研究發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物的OT神經(jīng)元主要存在于下丘腦大細(xì)胞核、視上核和室旁核,其神經(jīng)纖維主要投射到垂體后葉和正中隆起。段曉勤等、沈霞芬等在多種動(dòng)物的室旁核、視上核、穹窿周核、室周核、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦前核、環(huán)核和前聯(lián)合核等觀察到OT神經(jīng)元,本試驗(yàn)也在上述區(qū)域觀察到陽性神經(jīng)元及數(shù)量不等的陽性纖維。此外,在視前內(nèi)側(cè)核、視前外側(cè)核、視上彌散核、腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核等核團(tuán)亦看到一定數(shù)量的神經(jīng)元,出現(xiàn)陽性細(xì)胞部位達(dá)19個(gè)核團(tuán)(區(qū))。該結(jié)果與妊娠期、青年期奶山羊下丘腦中OT免疫反應(yīng)神經(jīng)元的分布相似。原位雜交試驗(yàn)結(jié)果表明,除了視上核和室旁核是下丘腦中表達(dá)OTmRNA的主要部位外,還在弓狀核、背內(nèi)側(cè)核、下丘腦背區(qū)、下丘腦后核、下丘腦室周核等23個(gè)核團(tuán)(區(qū))中均觀察到OTmRNA雜交信號(hào),說明下丘腦的大多數(shù)核團(tuán)(區(qū))自身就能合成OT,而非來自外源性的。Wathes等在山羊發(fā)情周期的第3～6d,每天給羊皮下注射100IUOT,可以使發(fā)情周期從21d縮短到7d;Homeida等給山羊和綿羊進(jìn)行OT主動(dòng)免疫,結(jié)果可以使發(fā)情周期顯著地延長,說明OT在發(fā)情周期中發(fā)揮著重要作用。Diana等研究表明,發(fā)情期大鼠的下丘腦中OTmRNA水平有微弱的增加,在大鼠的發(fā)情期,下丘腦中OTmRNA增多。OTmRNA的水平可被神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞和投射到大鼠的下丘腦或下丘腦外區(qū)域的小細(xì)胞神經(jīng)元協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。David等在妊娠期的大鼠下丘腦中也觀察到OTmRNA增加,而分泌OT的神經(jīng)元在形態(tài)和電生理方面均發(fā)生了改變。本試驗(yàn)結(jié)果表明,在發(fā)情期奶山羊下丘腦的15個(gè)核團(tuán)(區(qū))存在OT及OTmRNA共同分布表達(dá),在這些核團(tuán)中含有OT陽性細(xì)胞,并且細(xì)胞數(shù)量多于OTmRNA,OT在此時(shí)期多呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá),而OTmRNA大多呈中等陽性,這可能是OT經(jīng)下丘腦大部分核團(tuán)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)mRNA合成后,通過軸漿運(yùn)輸和血液傳送到達(dá)一定的核團(tuán),并在