PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用報(bào)告人：馮姣PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的優(yōu)勢PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的存在問題目錄PCR技術(shù)簡介Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。1983年,Mullis創(chuàng)造了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶〔Taq〕引入了PCR技術(shù)。1989年美國?Science?雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)創(chuàng)造之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎。PCR技術(shù)的創(chuàng)立史PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)的原理無細(xì)胞分子克隆法：在微量離心管中,參加適量的緩沖液,微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶,一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍;擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNA帶。PCR技術(shù)簡介PCR技術(shù)分類熒光定量PCR常規(guī)PCR檢測多重PCR檢測熒光定量PCR檢測IMS-PCR檢測PCR-DGGE在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的催化下，常規(guī)PCR檢測原理是在存在DNA模板、dNTP、引物、適當(dāng)緩沖液與MgCl溶溶液的反響混合物中，對一對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。多重PCR(multiplexPCR)的檢測原理與傳統(tǒng)PCR相同，如果存在與各引物對特異性互補(bǔ)的模板，只不過是在同一反響體系中參加1對以上的特異性引物，那么就可以同時(shí)在同一個(gè)反響管中擴(kuò)增出1條以上的目的DNA片段。使用這一方法可以同時(shí)檢測1個(gè)以上目的基因或者借助其交叉限制進(jìn)行確認(rèn)。與常規(guī)的PCR相比，還具有擴(kuò)增效率高、產(chǎn)物特異性高和經(jīng)濟(jì)簡便等特點(diǎn)，特別適合食品中多種致病菌的快速檢測.實(shí)時(shí)熒光定量是將熒光能量傳遞技術(shù)應(yīng)用于傳統(tǒng)多聚酶鏈?zhǔn)椒错憙x中，通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極–偶極相互作用。檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團(tuán)，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，從而到達(dá)定量目的。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了ＰＣＲ從定性到定量的飛躍，除了具有常規(guī)ＰＣＲ的快速、靈敏、操作方便等特點(diǎn)外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)：全封閉反響，無需凝膠電泳等ＰＣＲ后處理，減小對環(huán)境的污染；不使用有毒試劑，操作平安；定量準(zhǔn)確；儀器在線實(shí)時(shí)監(jiān)測，結(jié)果直觀免疫磁珠技術(shù)〔ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ〕其原理是磁珠經(jīng)過一定的處理后，可結(jié)合某種微生物特異性抗體，形成免疫磁珠。將這種帶有特異性抗體的免疫磁珠加到待測樣品中，相應(yīng)的抗原物質(zhì)就會和免疫磁珠上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原－抗體－磁珠免疫復(fù)合物，此復(fù)合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，使復(fù)合物與其他物質(zhì)別離，從而到達(dá)快速別離抗原物質(zhì)的目的。該技術(shù)不僅具備了固相化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)以及免疫學(xué)反響的高度特異性，還具有高效、快速、可重復(fù)性好、操作簡單和不需昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。PCR-DGGE的技術(shù)是將PCR和變性梯度凝膠電泳的(DGGE)分析技術(shù)結(jié)合起來是一種可將長度相同而序列不同的DNA片段混合物別離開的一項(xiàng)技術(shù)。DGGE的根本原理是：由于DNA分子中4種堿基的組成和排列存在差異，造成不同序列的DNA分子的解鏈溫度不同，解鏈時(shí)所需的變性劑的濃度也不同。當(dāng)雙鏈DNA分子在含梯度變性劑〔尿素、甲酰胺〕的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳時(shí)，會致使序列不同的DNA片段會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，從而使DNA分子的遷移速度不斷下降，當(dāng)產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相對平衡時(shí)，不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，形成相互分開的帶譜。理論上只要選擇的電泳條件足夠精細(xì)，有一個(gè)堿基差異的DNA長段都可以被分開。PCR-DGGE技術(shù)具有可檢測不可培養(yǎng)類細(xì)菌、檢測時(shí)間短、檢測率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。①檢測樣品經(jīng)預(yù)處理后獲得DNA模板；②DNA模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離后成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為其后階段反響做準(zhǔn)備；③模板DNA與引物的退火〔復(fù)性〕：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，這時(shí)人工合成的引物與模板DNA單鏈經(jīng)互補(bǔ)序列配對結(jié)合；④引物的延伸：DNA模板—引物結(jié)合物在耐熱DNA聚合酶的催化作用下，以4種三磷酸脫氧核苷酸為反響原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保存復(fù)制原那么，合成一條新的與模板DNA結(jié)構(gòu)組成相同的新鏈。重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的新鏈，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，一般單一拷貝的基因循環(huán)25~30次DNA便可擴(kuò)增l00萬~200萬倍。PCR反響產(chǎn)物再通過凝膠電脈和基因測序等DNA分析技術(shù)確定擴(kuò)增DNA序列的具體信息。PCR技術(shù)簡介PCR操作過程準(zhǔn)確性用傳統(tǒng)的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難，那是因?yàn)?，食品中污染微生物種類相當(dāng)多，即使是同一種食品中微生物種類也相當(dāng)多?？旖菪砸话愕母瘮【鷻z測至少需要2～5d，甚至7d以上，由此可見，傳統(tǒng)的檢測方法最大的缺點(diǎn)就是檢測需要時(shí)間太長了。檢驗(yàn)結(jié)果出來時(shí)通常產(chǎn)品已經(jīng)流向市場，對實(shí)際生產(chǎn)具有嚴(yán)重的滯后性。而PCR技術(shù)檢測食品微生物可以在1d之內(nèi)檢測出結(jié)果，甚至在幾個(gè)小時(shí)就可以得出檢測結(jié)果，對食品工業(yè)生產(chǎn)具有相當(dāng)好的指導(dǎo)作用。PCR技術(shù)檢測食品微生物的優(yōu)勢1.食