曲克蘆丁對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞分泌炎性因子pge2、il-1和nf-水平的影響

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ra）以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征。在多種炎癥因素的刺激下，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生，關(guān)節(jié)軟骨和骨進(jìn)行不良破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能障礙。PGE2、IL-1β和TNF-α都是RA發(fā)病過程中重要的細(xì)胞因子,PGE2在RA的發(fā)病機(jī)理中起著重要作用,它與RA的炎性水腫、疼痛、細(xì)胞因子分泌及軟骨下骨質(zhì)吸收與破壞等密切相關(guān);IL-1β可誘導(dǎo)RA關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖,刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生蛋白激酶;TNF-α可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,包括TNF-α本身和白細(xì)胞介素-1等。曲克蘆丁(troxerutin,3’,4’,7-三羥基乙基蘆丁)是天然蘆丁經(jīng)過羥乙基化制成的半合成黃酮類化合物,國內(nèi)產(chǎn)品是以曲克蘆丁為主的羥乙基蘆丁的混合物,其中曲克蘆丁的含量不低于80%,是目前臨床上治療心腦血管疾病的常用藥物,可用于治療急性缺血性腦損傷、中風(fēng)后遺癥和靜脈疾病。動(dòng)物研究顯示,曲克蘆丁可抑制小鼠肝細(xì)胞中NF-κB、iNOS和COX-2的上調(diào),表現(xiàn)出明顯的抗炎作用。本研究根據(jù)目前對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)和曲克蘆丁具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善血流變作用的最新研究進(jìn)展,采用大鼠足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑建立大鼠關(guān)節(jié)炎模型,通過體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞,觀察曲克蘆丁對(duì)關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌PGE2、IL-1β和TNF-α的影響,探討曲克蘆丁對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療效果是否與抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子有關(guān)。1材料和方法1.1動(dòng)物SD大鼠,普通級(jí),體重180～200g,雄性,由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):皖實(shí)準(zhǔn)01號(hào)。1.2實(shí)驗(yàn)用試劑曲克蘆丁片:山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,生產(chǎn)批號(hào)070714;阿司匹林腸溶片:亞寶藥業(yè)太原有限公司,生產(chǎn)批號(hào)070324;卡介苗:50mg/支,購自上海生物制品研究所,批號(hào)200702001。125I-PGE2-RIA試劑盒,購自蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部,批號(hào)090416;125I-TNF-αRIA試劑盒,購自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司,批號(hào)090325;125I-IL-1βRIA試劑盒,購自北京北方生物技術(shù)研究所,批號(hào)090408。1.3放射免疫計(jì)數(shù)Napco-6100型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,美國杜邦產(chǎn);J-1450型超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備公司;GC-911型γ放射免疫計(jì)數(shù)器,中國科技大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司;倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡,日本OLYMPUS公司;SK-Ⅰ型水浴箱,北京醫(yī)療設(shè)備廠;TGL-18R型冷凍離心機(jī),黑馬儀器公司;PHS-3C型精密pH計(jì),上海雷磁儀器廠。1.4大鼠血清中的致炎SD大鼠隨機(jī)均分為6組:正常組,模型組,曲克蘆丁18mg/kg、36mg/kg和72mg/kg組(按照人與大鼠體表面積換算公式計(jì)算,相當(dāng)于正常成人日用量的6倍)和對(duì)照組(阿司匹林30mg/kg),每組8只。除正常組外,其他各組均以弗氏完全佐劑(卡介苗80℃、1h水浴滅活后,與高壓滅菌的液體石蠟充分碾磨混勻,配成10mg/ml的乳劑)于每鼠左后足跖皮內(nèi)注射0.1ml致炎。各藥物組分別于致炎第14d開始灌胃給藥,連續(xù)8d,正常組及模型組給予等容積的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)。1.5滑膜細(xì)胞分離致炎后21d處死大鼠,無菌取出滑膜層組織?；ぜ?xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行。用膠腺酶-胰蛋白酶消化法分離得到的單個(gè)滑膜細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)液配制滑膜細(xì)胞懸液(5×108/L),加入24孔培養(yǎng)板中,每孔1ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,收集培養(yǎng)液,離心(300×g,10min)后,將上清液置-20℃冰箱保存待測(cè)。1.6體外滑膜細(xì)胞增殖反應(yīng)大鼠佐劑致炎后第21d,分離滑膜組織、培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化,用DMEM培養(yǎng)液配制滑膜細(xì)胞懸液(5×106/ml)接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)48h,用MTT法檢測(cè)體內(nèi)用藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎鼠滑膜細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。1.7不同試驗(yàn)方法取滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液,采用放射免疫測(cè)定法,分別按125I-PGE2RIA、125I-IL-1βRIA和125I-TNF-αRIA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS14.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞增殖功能MTT法檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常組相比,佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞的增殖功能亢進(jìn),曲克蘆丁(72mg/kg)可顯著降低其增殖反應(yīng)。與正常組比較,模型組的細(xì)胞增殖功能亢進(jìn)(P<0.01);與模型組比較,曲克蘆丁(72mg/kg)能顯著抑制細(xì)胞的增殖反應(yīng)(P<0.01),曲克蘆丁(36mg/kg)能抑制細(xì)胞增殖反應(yīng)(P<0.05),見表1。2.2不同程度下膝關(guān)節(jié)大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)的單因素實(shí)驗(yàn)表2結(jié)果顯示,正常組PGE2、IL-1β和TNF-α低表達(dá),模型組高表達(dá)(P<0.05或P<0.01);各曲克蘆丁治療組可不同程度地下調(diào)關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2、IL-1β和TNF-α水平,呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,以72mg/kg組的作用最為明顯(P<0.05或P<0.01)。進(jìn)一步對(duì)曲克蘆丁抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足腫脹(21d)與其抑制滑膜細(xì)胞分泌PGE2、IL-1β和TNF-α水平作線性回歸與相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)曲克蘆丁減輕足腫脹的作用與其抑制這些細(xì)胞因子的作用密切相關(guān)(表3)。3曲克蘆丁對(duì)膝關(guān)節(jié)大鼠滑膜細(xì)胞增殖的影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以滑膜細(xì)胞增生為顯著特征的系統(tǒng)免疫性疾病。正常生活狀態(tài)下,滑膜細(xì)胞的增殖率很低,而RA患者的滑膜細(xì)胞生長旺盛,呈現(xiàn)類似腫瘤組織的侵蝕性生長特性。RA的滑膜細(xì)胞在組織學(xué)上類似于腫瘤細(xì)胞,細(xì)胞核大、核仁明顯,尤其是關(guān)節(jié)軟骨或骨質(zhì)侵蝕部位的滑膜細(xì)胞。RA中的滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處于高度活化狀態(tài),可合成TNF-α、IL-1β、PGE2等多種炎性細(xì)胞因子。釋放入關(guān)節(jié)滑膜液及血液中的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、PGE2等有許多相似的生物學(xué)活性,如促進(jìn)滑膜纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生成膠原酶和前列腺素,誘導(dǎo)糖蛋白的分解與骨的吸收,抑制糖蛋白的合成與骨的形成,刺激B型滑膜細(xì)胞增生,使滑膜增厚,生成大量基質(zhì)金屬蛋白酶等。本研究通過對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞的增殖速度遠(yuǎn)快于正常組,關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2、IL-1β和TNF-α水平顯著升高,給予曲克蘆丁(72mg/kg)可使關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞亢進(jìn)的分泌功能得到改善。進(jìn)一步對(duì)曲克蘆丁抑制足腫脹與其對(duì)滑膜