利用pcr方法對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)性比的研究

性別評(píng)價(jià)在鳥(niǎo)類(lèi)生態(tài)、引進(jìn)繁殖和群體遺傳分析等方面起著重要作用。在鳥(niǎo)類(lèi)生態(tài)研究中，性別率是一個(gè)重要的參數(shù)，影響著種群的數(shù)量。為了確定種群內(nèi)或筑巢內(nèi)鳥(niǎo)類(lèi)的性別比例，正確、簡(jiǎn)單的性別評(píng)價(jià)方法是一項(xiàng)必要的技術(shù)。1鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定技術(shù)的必要性性別鑒定(sexidentification)是鳥(niǎo)類(lèi)學(xué)研究的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作.全世界的鳥(niǎo)類(lèi)中有60%是單態(tài)性鳥(niǎo)(monomorphicbirds),即雌雄同型.即使對(duì)于一些雌雄異型鳥(niǎo)類(lèi)來(lái)說(shuō),由于雛鳥(niǎo)性別指示的羽色特征還未出現(xiàn),判別其性別也很困難,只有在性成熟后,雌雄在形態(tài)上才有區(qū)別,因此對(duì)雛鳥(niǎo)進(jìn)行安全而準(zhǔn)確的性別鑒定非常困難.生境破碎化和非法狩獵已經(jīng)使很多鳥(niǎo)類(lèi)陷入了瀕危境地,為有效地保護(hù)珍稀瀕危鳥(niǎo)類(lèi),在建立人工種群進(jìn)行引種配對(duì)時(shí),鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定對(duì)于成功分離成對(duì)的親本,進(jìn)行有效的繁殖至關(guān)重要.在養(yǎng)殖業(yè)方面,通過(guò)鑒定1日齡雛雞的性別,可以淘汰非目的性別的個(gè)體,降低飼養(yǎng)成本,提高經(jīng)濟(jì)效益.因此,無(wú)論是為了保存物種、人工繁育還是科研,尤其是隨著一些野生珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的不斷滅絕,鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定技術(shù)的研究和建立都迫在眉睫.2增加了鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的方法目前性別鑒定的方法分三類(lèi):2.1形態(tài)學(xué)方法形態(tài)學(xué)方法主要有行為判定法;翻肛法;外科手術(shù)判定法;排泄物類(lèi)固醇判定法;叫聲判定法;體尺測(cè)量法;羽色伴性遺傳法;羽色伴性遺傳法等8種方法.這些方法各有不足之處,或費(fèi)時(shí),或費(fèi)力或?qū)B(niǎo)類(lèi)有較大的傷害性,精確度不高,而且需要專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員,對(duì)于珍稀鳥(niǎo)類(lèi)來(lái)說(shuō)尤為不適合.2.2細(xì)胞生物學(xué)方法細(xì)胞生物學(xué)方法主要利用Z、W染色體在形態(tài)上的差別,對(duì)性染色體進(jìn)行觀察,雌性的性染色體一條大(Z),一條小(W),而雄性個(gè)體兩條均較大(ZZ).通過(guò)判斷組織培養(yǎng)細(xì)胞性染色體是Z還是W來(lái)鑒定鳥(niǎo)的性別.其準(zhǔn)確率可達(dá)100%.該方法的缺點(diǎn)是分析性染色體需要用高質(zhì)量的分裂中期的細(xì)胞,取材比較困難,由于染色體數(shù)目大(40-126不等),分散難度高,而且染色體的大與小的分辨很容易造成人為的主觀差錯(cuò),不適合生產(chǎn)實(shí)際的應(yīng)用.另外由于采集樣本的要求造成對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的傷害性較大,不適于珍稀鳥(niǎo)類(lèi)的性別鑒定,但在其他鑒定方法建立過(guò)程中可以將其作為一種有效的檢驗(yàn)手段.2.3分子生物學(xué)方法20世紀(jì)以來(lái),鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定方法也隨著性別決定機(jī)制研究的深入得到同步發(fā)展,從個(gè)體水平、細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平.分子生物學(xué)方法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種利用性染色體連鎖基因探針和PCR擴(kuò)增技術(shù)鑒別鳥(niǎo)類(lèi)性別的新方法.分子生物學(xué)方法主要有以下五種:2.3.1DNA含量測(cè)定法由于W染色體比Z染色體小得多,因此每個(gè)雄性細(xì)胞的DNA含量比雌性的多.依此作為一種鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定分子方法,通常采用碘化丙錠(EB)對(duì)雌性和雄性細(xì)胞核進(jìn)行染色,再用流體細(xì)胞計(jì)進(jìn)行檢測(cè).雄性和雌性DNA總量的差別隨鳥(niǎo)類(lèi)的不同而不同,一般在0.6%~3.5%之間變化.2.3.2DNA印記雜交利用W染色體DNA的核酸探針與W染色體的DNA進(jìn)行特異性結(jié)合,作為鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的一種分子方法.1989年Uryu等對(duì)雞W染色體特異的XhoI家族的重復(fù)序列進(jìn)行了克隆和測(cè)序..1997年OgawaA等利用熒光標(biāo)記探針Southern雜交對(duì)幾乎所有的鳥(niǎo)類(lèi)包括平胸鳥(niǎo)類(lèi)都進(jìn)行了準(zhǔn)確的性別鑒定.利用DNA印記雜交技術(shù)能夠清楚地鑒定性別,但染色體特異性DNA探針?lè)ㄒ话惚容^費(fèi)時(shí),操作過(guò)程較復(fù)雜.2.3.3擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)是利用隨機(jī)引物擴(kuò)增來(lái)鑒別鳥(niǎo)類(lèi)性別的最常見(jiàn)的方法,在國(guó)外已有報(bào)道,這種方法可以從已知性別的鳥(niǎo)中擴(kuò)增出三種類(lèi)型的標(biāo)記物.這些標(biāo)記物大多數(shù)是單型,只有第二種類(lèi)型標(biāo)記物是多態(tài)的,且在雌雄個(gè)體之間不同.第三種類(lèi)型標(biāo)記被限制在單一性別中.一旦標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn),就能對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行性別鑒定.AFLP可以直接擴(kuò)增來(lái)自鳥(niǎo)類(lèi)性器官組織的DNA,然后進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增PCR.2.3.4隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)方法隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)方法與擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法相似,可以在不了解物種的基因組結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行多態(tài)性分析,通過(guò)對(duì)比雌雄鳥(niǎo)PCR產(chǎn)物來(lái)鑒定性連鎖標(biāo)記物.國(guó)外已有報(bào)道,1999年MathiasK?lliker等在研究大山雀雛鳥(niǎo)的性比時(shí),采用RAPD方法進(jìn)行性別鑒定.國(guó)內(nèi)楊光等也利用RAPD方法成功鑒別了3種鶴的性別.同AFLP法相比,RAPD法操作簡(jiǎn)單,樣品用量少、可用較短的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,由于具有較高靈敏度,可用瓊脂糖電泳對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比,無(wú)需聚丙烯酰胺電泳、輻射性標(biāo)記物和高壓液態(tài)色譜純化引物,因此RAPD法優(yōu)于AFLP法.RAPD法是鳥(niǎo)類(lèi)性別分子鑒定最初使用的方法.但是RAPD方法和AFLP方法工作量大,數(shù)據(jù)處理繁瑣,成本也很高,因此一般將這種方法作為發(fā)現(xiàn)新遺傳標(biāo)記的基礎(chǔ)方法.可以通過(guò)隨機(jī)擴(kuò)增找出適合于廣泛鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的通用序列進(jìn)行新引物和新方法的研究.2.3.5聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法針對(duì)性染色體特異基因序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法使性別鑒定取得了突破性的進(jìn)展,提供了對(duì)單態(tài)性鳥(niǎo)和雛鳥(niǎo)實(shí)施安全、快速、準(zhǔn)確、高效性別鑒定的新方法,也是迄今發(fā)現(xiàn)適用范圍最廣、最為簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠的、常見(jiàn)的鳥(niǎo)類(lèi)性別鑒定的方法.PCR方法的關(guān)鍵是尋找一個(gè)性別連鎖的標(biāo)記物,所以凡是W染色體上的特異序列或基因便成為人們尋找的主要目標(biāo).截至目前,已發(fā)現(xiàn)了在W染色體上幾個(gè)基因(CHD基因和ATP5A1-W基因)和一個(gè)假基因序列(EE0.6序列),它們的進(jìn)化速率很慢,對(duì)于鳥(niǎo)類(lèi)是非常保守的,可以依此進(jìn)行性別鑒定.ATP5A1基因在W、Z染色體上以不同形式的序列出現(xiàn),此基因的保守性不是很好.在不同種鳥(niǎo)中基因的序列有差異,這給性別鑒定工作增加了很大的工作量.ATP5A1基因是用于多數(shù)平胸鳥(niǎo)類(lèi)和非平胸鳥(niǎo)類(lèi).EE0.6(0.6kb-EcoRI-fragment)序列長(zhǎng)度大約為600bp,含有EcoRI片段,是一段單一序列,包含了一段類(lèi)似于外顯子的序列-ET15,在W、Z上有一段同源序列,但它們?cè)诖蟛糠中蛄猩蠀s存在差異,可以通過(guò)選擇合適的引物對(duì)W染色體上的特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果雄性不被擴(kuò)增,而雌性會(huì)產(chǎn)生一條擴(kuò)增帶,因此得以區(qū)別.擴(kuò)增EE0.6序列片段的性別鑒定方法適用于許多非平胸鳥(niǎo)類(lèi).CHD基因全稱(chēng)為染色體螺旋蛋白基因(chromobox-helicase-DNAbindinggene),此基因非常保守,在非平胸鳥(niǎo)類(lèi)中有兩個(gè)同源拷貝CHD-W和CHD-Z,其中CHD-W為W連鎖,CHD-Z為Z連鎖.兩者的外顯子序列和大小相似,內(nèi)含子大小卻有很大差別.根據(jù)這個(gè)特性,利用內(nèi)含子兩側(cè)保守序列設(shè)計(jì)特異性引物(P2/P3;P2/P8;2550F/2718R;2945F/3224R;P14/P9;1237L/1272H),直接通過(guò)特異性引物對(duì)Z和W兩個(gè)染色體上不同大小的特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)結(jié)果將表現(xiàn)為:雌性為兩條帶;雄性為一條帶.到目前為止CHD基因性別鑒定已經(jīng)十分廣泛的應(yīng)用于非平胸類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi),包括:雁形目、雞形目、雀形目、鸻形目、鷗形目、隼形目、鸚形目、鸛形目和鶴形目等.PCR方法所需DNA樣品量少,不受樣品年齡限制且樣品純度要求校低,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物,可以利用雙陽(yáng)性結(jié)果判斷雌雄,結(jié)果更準(zhǔn)確.該方法操作簡(jiǎn)便,可以做到高通量地鑒定鳥(niǎo)類(lèi)性別.但是,PCR方法需嚴(yán)格控制樣品間交叉污染,以確保結(jié)果準(zhǔn)確.3鳥(niǎo)類(lèi)代性比及分化兩性種群內(nèi)雄性個(gè)體與雌性個(gè)體的相對(duì)比例稱(chēng)為性比(sexratio).性比經(jīng)常隨年齡發(fā)生改變.原始性比,即初級(jí)性比(primarysexratio)是指合子剛形成時(shí)的性比;次級(jí)性比(secondarysexratio)是親代投入結(jié)束時(shí)的性比.性比對(duì)種群配偶關(guān)系及繁殖潛力有很大影響,它決定有效種群的大小,是種群走向繁榮還是沒(méi)落的一個(gè)重要指標(biāo).就種群性比而言,其意義將隨各物種的雌雄關(guān)系而不同.對(duì)于單配(monogamy)的動(dòng)物(如一雄一雌制)來(lái)說(shuō),性比1∶1對(duì)于種群增長(zhǎng)最有利,偏離此比例則意味著有一部分雌性或雄性成體不能參加繁殖,參加繁殖的個(gè)體數(shù)減少,交配幾率降低,未受精卵增加,卵的孵化率也隨之降低,最終導(dǎo)致了有效種群縮小,從而影響和制約了種群的發(fā)展.對(duì)于多配制(polygamy)的動(dòng)物(如一雄多雌制),雌性比例的增加意味著出生率的提高,參加繁殖的個(gè)體數(shù)增加,有效種群不斷擴(kuò)大,種群逐漸走向繁榮.由于鳥(niǎo)類(lèi)后代(雛鳥(niǎo))性比是鳥(niǎo)類(lèi)種群性比最重要的決定因素,因此近些年,通過(guò)CHD基因?qū)B(niǎo)類(lèi)后代的性比進(jìn)行研究已經(jīng)炙手可熱,有很多學(xué)者對(duì)不同鳥(niǎo)類(lèi)或同種鳥(niǎo)類(lèi)的不同種群的性比進(jìn)行研究.2004年Catty等人利用CHD基因?qū)t亞鴝(Erithacusrubecula)的一個(gè)越冬群體的性比進(jìn)行了研究,研究發(fā)現(xiàn)在南部的伊比利亞冬季鷗亞鴝雌性個(gè)體數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄性個(gè)體數(shù),從而證明此物種在遷徙過(guò)程中與性別有關(guān).也有許多學(xué)者圍繞著各種可能影響鳥(niǎo)類(lèi)后代的性比及分化因素進(jìn)行了大量研究.1999年MathiasK?lliker等在研究大山雀雛鳥(niǎo)的性別比率與雄性親鳥(niǎo)的體型間的關(guān)系時(shí),發(fā)現(xiàn)一夫一妻制的大山雀在一窩中后代雄鳥(niǎo)的比率明顯地隨著雄性親鳥(niǎo)的跗骨的長(zhǎng)度而增加,并且也隨著胸紋的大小而增加.2000年Oddie也提出雌雄雛鳥(niǎo)體形的大小差異產(chǎn)生的競(jìng)爭(zhēng)影響著大山雀后代的性別分配;2001年Yamaguchi和Kawano對(duì)雜色山雀P.v.namiyei性比差異進(jìn)行了3年多的研究,同樣發(fā)現(xiàn)個(gè)體大的雄性(例如跗趾骨長(zhǎng)的雄性)趨向于有較高的維持資源的潛力,每窩雄性雛鳥(niǎo)的比率與雄性親鳥(niǎo)跗趾骨長(zhǎng)度有很大關(guān)系,且跗趾骨長(zhǎng)度是可遺傳的特征,雌性個(gè)體根據(jù)雄性個(gè)體的身體大小對(duì)性比作適當(dāng)調(diào)整.2001年Jennifer等認(rèn)為,一些物種的雌性個(gè)體能夠使后代產(chǎn)生性比偏差(sex-biased).在鳥(niǎo)類(lèi)中,這種偏差可能是由于雌性個(gè)體非隨機(jī)性排卵順序,造成含Z和W性染色體的卵非隨機(jī)的排出所致.通過(guò)對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)的后代的性別鑒定發(fā)現(xiàn)蛋的質(zhì)量和大小與后代的性別存在著相應(yīng)的變化;也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些鳥(niǎo)類(lèi)孵化順序影響著后代的性別,例如黑頭礦鳥(niǎo)(Manorinamelanocephala)由于雄性后代能幫助母體照顧后代,所以通常第一個(gè)孵化出的是雄性鳥(niǎo);通過(guò)對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)后代的性比研究發(fā)現(xiàn),一些鳥(niǎo)類(lèi)棲息地條件也是后代性比的影響因素,例如Sheldon的研究表明,在不同的環(huán)境條件下,親代將會(huì)調(diào)節(jié)對(duì)后代投