組織塊石蠟包埋的步驟：取材：盡量活殺，在處死30min內(nèi)取材完畢，組織塊的大小一般為（組織塊石蠟包埋的步驟：取材：盡量活殺，在處死30min內(nèi)取材完畢，組織塊的大小一般為（1.0-1.5cm）*1.0cm*（0.2-0.3cm）固配定制：而月）沖洗：將組織塊放在固定的容器中用流水沖洗24h.I242%h是胛醛溶冰液和可放置1:9-押6.硬蠟I40min），脫水：一次70%酒精2h,80%酒精2h,90%酒精1h,95%酒精40min,無水乙醇I40min,無水乙醇H30min?？蓪⒔M織放于70%酒精中過夜透明：將脫水后組織直接浸入二甲苯透明劑中（二甲苯I甲苯H）,每次透明為10min。浸蠟:＞規(guī)制片常用熔點(diǎn)高于56C以上的石蠟，普通采用56C-58C石蠟。先將組織浸入軟蠟I1h左右,f再浸入軟蠟H40min;硬蠟I40min,硬蠟H1h。（一般浸蠟時(shí)間為3-4h）軟蠟熔點(diǎn)為45C-50C,硬蠟熔點(diǎn)為55C-60C一起的-:l7.擺包正埋并：將鋪蠟平液，注然入后包移埋至硬冷具卻中臺(tái)，，迅使速組將織組塊織同塊蠟平液放凝入固蠟在液一中起過程。（硬蠟?zāi)潭ㄐ停┮黄鸬?:l石蠟切片法：在切片前應(yīng)先切去標(biāo)本周圍過多的石蠟（此過程稱為“修塊”但也不能留得太少，否則易造成組織破壞，連續(xù)切片時(shí)分片困難。般切片厚度為4-6gm“亠貼片時(shí)先在干凈的載玻片上涂一層蛋白甘油，然后于人60C?溫箱中烘烤1h,若未烤干可適當(dāng)延長時(shí)間；寺組織剝脫可涂一層蛋清加以固定。做免疫組化時(shí)，玻片應(yīng)涂多聚賴氨酸，亦可買防脫玻片。HE染色的步驟：二甲苯I5-10min宀二甲苯H5-10min宀無水乙醇I1-3min宀無水乙醇H1-3min—90%酒精1min—80%酒精1mn—70%酒精1min—水洗t蘇木精3-5min—水洗—鹽酸酒精1-3s—水洗—飽和碳酸鋰（氨水）10-30s—水洗—伊紅3-5min—水洗（短）—70%酒精1-2s—80%酒精3-5min—90%酒精3-5min—95%酒精3-5min—無水乙醇5-10min—二甲苯I3-5min—二甲苯H3-5min—中性樹膠封片染色液的配制：Harris蘇木精的配制蘇木精1g硫酸鋁鉀15g無水乙醇10ml蒸餾水200ml先用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀，用無水乙醇溶解蘇木精再倒入已溶解的硫酸鋁鉀蒸餾水中，煮沸1min后，稍冷卻，慢慢加入紅色氧化汞0.5g，繼續(xù)加熱至染液變?yōu)樽霞t色，用紗布蓋瓶口，用濾紙過濾后每100ml加冰醋酸5ml伊紅的配制伊紅1g90%酒精100ml先將伊紅溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。鹽酸酒精分化液的配制：濃鹽酸0.1-1ml75%酒精99ml常I,▼ 常I,▼ ，'* I—、■于無水乙醇常規(guī)石蠟水化,將石蠟切片浸于二甲苯中5min,三次。取出切片置于無水乙醇中2次，每次3min;90%酉精、80%酒精、70%酒精，各三次。取出置于蒸餾水中溫孵育2-3h,用PBS?中,浸泡5min,三次。取取出蒸餾水中的切片,甩干并擦干切片上組織周圍的液體,平放于濕盒中,滴加過氧化物酶阻斷劑（常用0.3%過氧化氫）于組織上避光孵育溫孵育2-3h,用PBS?中,浸泡5min,三次。取滴加50-100匕I二抗工作液于組織上，亠洗切片。將切片置于TBS或PBS緩沖液「一p ,出切片,甩干并擦干切片上組織周圍的液體,平放于濕盒中滴加50-100卩l(xiāng)A液于組織上，室溫孵育30min,用PBS中洗切片將切片置于TBS或PBS緩中中液中，浸泡5min，三次。取出切片，甩干并擦干切片上組織周圍的液體,平放于濕盒中。滴加預(yù)備好的顯色劑DAB工作液50-100滴加預(yù)備好的顯色劑DAB工作液50-100卩，— 或光鏡下控制顯色。顯色完全后，用蒸餾水沖洗終止顯色需要時(shí)，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化1-2s，水洗。各級(jí)酒精（70%80%90%無水乙醇I、無水乙醇H）脫水,每級(jí)3min,取出切片置入二甲苯5min,二次。用中性樹膠封片。rr-ti 1 丿。SABC式劑盒組分：AchemMateTMEnVision+/HRP,兔、小鼠1x5mlBDAB緩沖稀釋液 2 x6.25mlCDAB原液 1 x0.25mlDAB工作液的配制：液實(shí)驗(yàn)前原液毫的濃度配制所需稀釋液量中加合后備或20微升）CPBS緩沖液配制:1xPBS(1000ml)Nacl(137mM)4g

Kcl(2.7mM)0.1gNa2HPO4(10mM)0.72gK2HPO4(2mM)0.12g5xPBS(500ml)Nacl(137mM)10gKcl(2.7mM)0.25g孵育3h孵育3hTOC\o"1-5"\h\zNa2HPO4(10mM)1.8gK2HPO4孵育3h孵育3hTGF1:50-1:200 1:100MMP1:50-1:200 1:100二抗羊抗兔1:400稱取子宮肌瘤和瘤旁組織50-100mg,放入3.5mmRNasFreedish稱取子宮肌瘤和瘤旁組織50-100mg,放入3.5mmRNasFreedish中，先加入4C預(yù)冷的Trizol500卩一亠-用3%雙氧水或氯仿浸泡30min,或用織盡可能剪碎，再加入500[1lTrizol管中。室溫放置5min,加入4C預(yù)冷的氯仿0.2ml/mlTriz區(qū)顛倒混勻（可劇烈），要充分至出現(xiàn)均勻乳糜狀為止，然后靜置5min,4C,14000rpmx15min。小心收集上層水相約6001l，置于另一個(gè)丘卩管（RNaseFree），用眼科剪（RNaseFree:DEPC水浸泡12h）將組，混勻后轉(zhuǎn)入RNaseFreeEP中，避免吸到中間層和有機(jī)相加入500卩l(xiāng)預(yù)冷的異丙醇（0.5ml異丙醇/mITrizol）,顛倒混勻3-5次，-20C放置1h或室溫靜置10min。棄上清20用濾紙吸干管口的心后能倒置于濾沉淀晾于EP管底部，加入1ml-20C預(yù)冷的75臨醇（含DEP）洗滌RNA沉淀。4C,12000rpmx5min。棄上清，加入1ml-20C預(yù)冷的無水乙醇，不要沖起沉淀，立即離心，4C,12000rpmx5min。管，棄上清，沉淀中即為總、RNA將EP管倒置于濾紙上，空氣中干燥10min,不能干燥過度。加入20卩l(xiāng)RNaseFreeHO溶解沉淀，分裝5卩l(xiāng)/管，-70C冰箱保存。管，夂?？倎砼许戣b定諾降脂糖電蛋定定儀瞧觀R1現(xiàn)量和純整夂。1%瓊脂糖電泳制膠:15ml0.5xTBE+0.125g瓊脂糖+2.4口1核酸染料上樣：2l5xloadingbuffer+3卩l(xiāng)樣本+5卩l(xiāng)DEPC水150V30min

測RNA含量:2卩I樣本+98卩IDEPC水TBE電泳緩沖液配制：10XPH7.0TTris 堿27gB 硼酸13.75gEEDTA 7.44g三蒸水500mlRT-PCF步驟：RT:1.按下列組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：(11)Mgcl22al⑻10xRTBuffer1al⑸RNaseFreedH2O3.75al⑽dNTPmixture(各10mM)1a1(2)RNaseInhibitOr0.25al⑴AMVReverseTranscriptase0.5al⑷OligodT-AdaptorPrimer0.5al實(shí)驗(yàn)樣品RNA(<500ngtotalRNA)1altotal10al/sample2. 按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（一個(gè)循環(huán)）99C(30C10min )42C5C5min425minC-60C15-30min60min95C5min5C5minPCR:1.配制PCF反應(yīng)液100-500bp⑼5xPCRBuffer10al火菌蒸餾水28.75al⑹TakaiRaExTaqHS.0.25al^游特f異7EPCR引物0.5al :下游特性匚PCR引物0.5alcDNA10altotal50al/sample2. 反應(yīng)條件(25-35個(gè)循環(huán))94 °C 30sec55C-65C30sec72C1min/kbp1Hid3TmP0>>0sco①2Holds94C94C退火溫度72C72C4CI5min30se30sec1min 7min_昴PCR凝膠電泳制膠：（1.5%）15ml0.5xTBE+0.225g瓊脂糖+1.9卩l(xiāng)核酸染料上樣：2I6xloadingbuffer+7卩l(xiāng)樣本+3卩I滅菌蒸餾水TGF-length335 57OCSense5CACAGTCCGCTACT