中藥復(fù)方五子衍宗丸對糖尿病性白內(nèi)障小鼠氧化損傷的影響

五子衍宗丸來自明代王肯堂的證據(jù)。該方是防治眼科疾病的經(jīng)典名方,現(xiàn)代大量臨床報道顯示其防治糖尿病性白內(nèi)障療效獨特。本實驗旨在探討五子衍宗丸抗糖尿病性白內(nèi)障(DC)的作用機制,主要從檢測小鼠血清及晶狀體MDA含量、SOD、GSH-Px活性及晶狀體混濁度等方面闡明中藥復(fù)方五子衍宗丸抗氧化損傷的機理,為該方研發(fā)成防治DC的新型中藥制劑提供理論依據(jù)。1材料表面1.1動物藥品的配制D-半乳糖(C6H12O6),分子量為180(上海生化制劑廠),批號:20030805,10%D-半乳糖溶液的配制方法:準確稱取25gD-半乳糖粉末置于燒杯中,用適量的蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)于250mL容器中,加蒸餾水至刻度,靜置后放入冰箱中貯藏備用;五子衍宗丸(北京同仁堂股份有限公司)批號:2030142,成人口服,1次6克,1日2次。動物用劑量按體表面積法折算。氯化鈉注射液(甘肅扶止制藥有限公司),批號:200010081-1;維生素C片(西安利君精華藥業(yè)有限責(zé)任公司)批號:20030604;超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒,均由南京建成生物工程研究所提供。1.2動物昆明種小鼠,雌雄各半,體重20±1g。由衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所提供(醫(yī)動字:14-005)。1.3儀器電動儀器臺(裂隙燈)由蘇州醫(yī)療器械廠制造。2方法2.1各組五子衍宗丸治療預(yù)防組將50只小鼠,隨機分為5組,空白組(A組),模型組(B組),維生素C組(C組),五子衍宗丸預(yù)防組(D組),五子衍宗丸治療組(E組)。2.2下腹注射針注射B、C、D、E4組以左手抓住小鼠,使腹部向上,碘伏消毒后下部,右手將注射針頭于左下腹部刺入,使針頭向前推進0.5~1.0cm,再以45度角穿過腹肌固定針頭,緩緩注入10%半乳糖溶液25mL·kg·d,空白組以同樣方法腹腔注射相應(yīng)量生理鹽水。造模時間20d。2.3造模前后小鼠國中小鼠有機物質(zhì)的分離B、C、E組造模時不給藥。D組在造模同時五子衍宗丸水煎劑灌胃預(yù)防,劑量為1.875g·kg·d,至造模結(jié)束。造模結(jié)束后,C組以維生素C水煎劑灌胃治療,劑量0.31g·kg·d,E組用五子衍宗丸水煎劑灌胃治療,劑量1.875g·kg·d。1次/d,連續(xù)20d。B、C、D、E組在造模結(jié)束后用裂隙燈檢查晶狀體混濁度,然后斷頭處死B、D組小鼠,摘取晶狀體并采血;A、C、E3組在治療后用裂隙燈檢查晶狀體混濁度,然后處死,摘取晶狀體并采血。2.4形態(tài)不常用的腸道取樣共分5級:Ⅰ級,無混濁(晶狀體透明清亮);Ⅱ級,較混濁(僅赤道部有空泡);Ⅲ級,明顯混濁(空泡擴展到中央);Ⅳ級,核混濁(晶狀體只在中央呈現(xiàn)核性白內(nèi)障):Ⅴ級,整個晶狀體完全性白內(nèi)障。2.5抗氧化指標的測定晶狀體加適量生理鹽水,在玻璃勻漿器內(nèi)研磨5min,冰水浴條件下,制成10%組織勻漿。組織勻漿、血漿分別離心10min(3000r/min),取組織勻漿、血漿上清液分別進行下述指標測定:①超氧化物歧化酶(SOD)活力測定,采用黃嘌呤氧化酶法。②谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活力測定,以催化還原型谷胱甘肽GSH的反應(yīng)速度來表示。③丙二醛(MDA)的含量測定,采用硫代巴比妥酸TBA法測定。2.6統(tǒng)計方法晶狀體混濁程度按分級以Ridit分析法檢驗,計量資料用SPSS軟件作單因素方差分析。3結(jié)果3.1表1顯示了五子衍宗丸對實驗小鼠結(jié)晶污染的影響3.2表2顯示了五子衍宗丸對實驗小鼠晶酸自由基代謝的影響3.3表3顯示了五子衍宗丸對實驗小鼠血漿自由基代謝的影響4半乳糖治療前后小鼠免疫調(diào)化指標糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機理主要有滲透壓學(xué)說,非酶糖基化學(xué)說以及氧化損傷學(xué)說,其中晶狀體的氧化損傷被認為是糖尿病性白內(nèi)障的一個主要激發(fā)因素。體內(nèi)過氧化脂質(zhì)水平的高低反映了機體脂質(zhì)受自由基攻擊損傷的程度,而過氧化脂質(zhì)的最終主要產(chǎn)物是丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)是公認的機體酶促類自由基防御系統(tǒng),它們對清除自由基、保護細胞組織起著重要作用。實驗研究表明腹腔注射D-半乳糖溶液后,晶狀體和血清SOD,GSH-PX的活性明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01);晶狀體混濁度檢查結(jié)果顯示:小鼠隨著半乳糖注射量的積累,在造模結(jié)束后,模型組有4只眼睛晶狀體出現(xiàn)輕度混濁,6只高度混濁;維生素C組有5只眼睛晶狀體輕度混濁,5只高度混濁;說明晶狀體和血清SOD,GSH-PX的活性明顯降低,產(chǎn)生大量的氧自由基不能清除而對晶狀體造成氧化損傷,導(dǎo)致過氧化脂質(zhì)產(chǎn)物丙二醛(MDA)的堆積是誘發(fā)糖尿病性白內(nèi)障的主要原因之一。經(jīng)五子衍宗丸治療后實驗小鼠晶狀體和血清SOD,GSH-PX活力與模型組比較明顯升高(P<0.05或P<0.01),MDA含量明顯降低(P<0.01)。晶狀體混濁度檢查結(jié)果顯示:在治療后,中藥治療組有6只眼睛晶狀體無混濁,4只輕度混濁,有6只小鼠晶狀體透明清亮,占總數(shù)的60%。說明五子衍宗丸是通過提高晶狀體和血清SOD,GSH-PX活性,清除過多的氧自由基而對抗D-半乳糖所致的氧化損傷,延緩糖尿病性白內(nèi)障病變發(fā)展的進程。中藥預(yù)防組小鼠晶狀體和血清SOD,GSH-PX測定值均有一定程度改善。晶狀體混濁度檢查結(jié)果顯示:在造模結(jié)束后,預(yù)防組有6只眼睛晶狀體無混濁,2只輕度混濁,