淺論家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥研究中pGBKT7【摘要】目的構(gòu)建能在酵母菌AH109中表達(dá)的mSOD1cDNA的穿梭表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突變SOD1編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。方法通過PCR法以真核表達(dá)載pEGFP-mSOD1cDNA為模板，擴(kuò)增獲得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA結(jié)合域的片段，經(jīng)過SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，基因重組的方法定向亞克隆于酵母雙雜交載體pGBKT7中，構(gòu)建形成pGBKT7-mSOD1真核表達(dá)載體。結(jié)果經(jīng)轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒雙酶切，核苷酸測序，BALST比對鑒定表明構(gòu)建成功。結(jié)論成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pGBKT7-mSOD1cDNA，為深入研究突變的SOD1基因編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】酵母雙雜交載體亞克隆mSOD1cDNApGBKT7

Abstract:ObjectiveToConstructofpGBKT7mSOD1YeastTwoHybridExpressionVectorinstudyoffamilialamyotrophiclateralsclerosisandtostudyProteinproteininteractionsofmutationSOD1encodeprotein.MethodsWegotthemSOD1fragmentfrompEGFPmSOD1bypolymercasereaction(PCR).AfterdigestionbySalⅠandEcoRⅠ,mSOD1fragmentwassubcolonedintoYeastTwoHybirdexpressionvectorpGBKT7.ResultsAtlast,pGBKT7mSOD1YeastTwoHybridexpressionvectorwasconstructedandconfirmedbyRedigestion.ConclusionTheconstructionofpGBKT7mSOD1ishelpfultothestudyingofProteinproteininteractions.

Keywords:YeastTwoHybird;expressionVector;subclone;mSOD1CcDNA;pGBKT7

根據(jù)超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)含金屬的不同，可將其分為3種，分別為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD，哺乳類動(dòng)物體內(nèi)，僅含有Cu,Zn-SOD與Mn-SOD。分布在胞漿中Cu,Zn-SOD，稱為SOD1；分布于線粒體中Mn-SOD，稱為SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD稱為SOD3,其中SOD1是細(xì)胞中高水平表達(dá)的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小組在對一個(gè)肌萎縮側(cè)索硬化癥家系致病基因的研究中發(fā)現(xiàn)［2］，SOD1第二號外顯子出現(xiàn)突變，測序分析證實(shí)第2號外顯子編碼區(qū)插入了一個(gè)堿基A，第2外顯子的插入突變導(dǎo)致SOD1轉(zhuǎn)錄和翻譯時(shí)閱讀框改變，結(jié)果SOD1翻譯提前終止，研究小組把這108個(gè)堿基對的cDNA暫命名為mSOD1cDNA,提交GenBank，獲得的編號是EF143990。本文報(bào)告載體pGBKT7-mSOD1cDNA構(gòu)建，為研究mSOD1基因突變編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

材料

主要試劑：限制性內(nèi)切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶購自大連Takara公司。DNA連接試劑盒購自美國MBI公司，卡那霉素購自上海華美公司，質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Promega公司。

菌株和質(zhì)粒：pGBKT7購自美國BDClontech公司，pEGFP-mSOD1為本課題組提供，大腸桿菌DH5α為燒傷研究所提供。根據(jù)mSOD1cDNA的序列設(shè)計(jì)引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5‘-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3‘,pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5‘-gacGTCGACATGCTTCCC

CACACCTTCATCT-3‘，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

儀器設(shè)備：臺式離心機(jī)(上海安亭科儀廠生產(chǎn))，PCR儀(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))，電泳儀(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))，手提紫外燈(美國Upland公司生產(chǎn))，凝膠成像儀系統(tǒng)GelDoc2000(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))

方法

PCR反應(yīng)：以pEGFP-mSOD1cDNA為模板，無核酸酶去離子水μL，10×PCRbuffer(mg2+free)5μL,dNTP()4μL,Mgcl2(25mM)3μL,上游引物μL，下游引物μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)μL,總反應(yīng)體系50μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，緊跟30個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)94℃變性30s,55℃復(fù)性30s，72℃延伸30s,最后72℃延伸10min補(bǔ)齊末端。

PCR產(chǎn)物電泳及低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收和純化：取PCR反應(yīng)物5μL經(jīng)%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果擴(kuò)增出一條約120bp的片段。取余下的PCR產(chǎn)物45μL行%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5μL經(jīng)%瓊脂糖凝膠電泳，并測序。

mSOD1酵母雙雜交表達(dá)載體pGBKT7-mSOD1cDNA構(gòu)建：分別以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pGBKT7和mSOD1回收純化酶切片段及線性化載體，在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞α,將pGBKT7-mSOD1cDNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接種于卡那霉素選擇培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h，挑出陽性菌落搖菌，采用小質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA測序和BLAST比對。

2結(jié)果

mSOD1cDNA片段的擴(kuò)增以含有mSOD1cDNA片段的真核表達(dá)載體pEGFP-mSOD1為模板，擴(kuò)增mSOD1cDNA片段，長度120bp，如圖1所示。圖2為膠回收驗(yàn)證回收效果，從電泳圖看膠回收效果滿意。

mSOD1PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

mSOD1PCR產(chǎn)物測序的序列結(jié)果：

GAATTCatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcat

catcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagatgaaggtgtggggaagcatGTCGAC

mSOD1PCR產(chǎn)物測序的序列(圖3，見封2)

測序圖各峰整齊，無重疊，該P(yáng)CR產(chǎn)物測序結(jié)果滿意和可信。

mSOD1cDNA酵母雙雜交載體的亞克隆將經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切的mSOD1cDNA與線性化的pGBKT7連接，轉(zhuǎn)化，提質(zhì)粒，酶切結(jié)果如圖4、5。將構(gòu)建的載體命名為pGBKT7-mSOD1cDNA。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序和BLAST比對結(jié)果

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序序列結(jié)果：

CGAGCCGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGG

AGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCGAC

GAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAG

GGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAG

ATGAAGGTGTGGGGAAGCATGTCGACCTGCAGCGGCCGCA

TAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA

GGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAA

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序結(jié)果圖譜：(圖6，見封2)

把mSOD1cDNA構(gòu)建到載體pGBKT7上，測序圖峰值整齊，無重疊。

BLAST比對結(jié)果

經(jīng)過BLAST比對mSOD1cDNA完全與pGBKT7相連。

3討論

酵母雙雜交技術(shù)是20世紀(jì)90年代興起的一種研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的高新分子生物學(xué)技術(shù)［3］，依據(jù)真核轉(zhuǎn)錄因子的DNA域和活性域分離的特性將兩者分離，即將酵母的轉(zhuǎn)錄因子GAL4分為GAL4BD和GAL4AD。將擬研究的靶蛋自(prey)和釣餌蛋自(bait)分別與GAL4AD、GAL4BD結(jié)合形成融合蛋白，只有當(dāng)靶蛋白與誘餌蛋白相互作用時(shí)，GAL4調(diào)控的報(bào)告基因才能表達(dá)，酵母才能在選擇性培養(yǎng)基中生長。該技術(shù)不僅用于驗(yàn)證己知蛋白之間的相互作用,亦可以自酵母雙雜交庫中尋找與誘餌蛋白相結(jié)合的新的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)新基因。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一種金屬酶，它可以使超氧陰離子O2-歧化為過氧化氫和分子氧，故在維持生物體內(nèi)氧自由基的平衡方面起重要作用。研究表明,基于其細(xì)胞定位，認(rèn)為SOD1主要參與防御外周質(zhì)及來自外界環(huán)境中的超氧化物對機(jī)體的毒害［4-5］。

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種以腦和脊髓中大的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，5%～10%的患者有家族性。臨床表現(xiàn)為緩慢起病，進(jìn)行性發(fā)展，逐漸出現(xiàn)四肢肌肉的無力、萎縮，伴錐體束征等。臨床治療非常困難。目前己肯定編碼銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase，Cu/ZnSOD)的SOD1基因突變可引起部分家族性ALS的發(fā)病［6］。SOD1基因突變類型多達(dá)100種以上［7］。為了進(jìn)一步研究該家系的發(fā)病機(jī)理，本文利用PCR技術(shù)和分子克隆方法，把mSOD1cDNA的序列亞克隆到酵母雙雜交的表達(dá)載體pGBKT7中，目的是為下一步酵母雙雜交打下基礎(chǔ)，也是深入研究突變的SOD1編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵步驟之一。

【參考文獻(xiàn)】

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