甲硝唑與牛血清白蛋白作用的對比研究

硝基溶膠（met）是當前結(jié)構(gòu)的簡單結(jié)構(gòu)（見圖1）。廣泛使用且廉價的抗厭氧菌藥物用于抗厭氧菌感染，如腹腔、胃腸道、女性殖器、下呼吸道、皮膚、軟組織、骨骼和關(guān)節(jié)。它也用于抗凝劑和替代物。血清蒼白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)。它可以與許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合。藥物研究和血清蒼白是闡明藥物儲存和運輸過程、藥物設計和開發(fā)以及藥理學研究的價值。這是當今科學研究、化學和臨床醫(yī)學的一個共同興趣和興趣。熒光光譜是研究生物大分子與有機小分子相互作用的重要手段之一.共振光散射光譜是一種新的分子光譜技術(shù),由于這種技術(shù)在研究生物大分子識別、組裝和聚集時呈現(xiàn)出靈敏而豐富的信號,已廣泛用于生物大分子的定量分析.但應用共振光散射光譜研究藥物與生物大分子作用機理未見報道本文用熒光光譜在模擬人體生理pH值條件下研究甲硝唑與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用機理的同時,用共振光散射光譜討論MET與蛋白質(zhì)的結(jié)合機理,發(fā)現(xiàn)兩種光譜得到的不同溫度下MET對蛋白質(zhì)的猝滅常數(shù)KSV、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB、表觀結(jié)合常數(shù)KA均在相同的數(shù)量級范圍內(nèi),MET在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點數(shù)均近似為1.本文還報道了MET與BSA間的熱力學參數(shù)、作用力、作用距離等重要信息及MET對BSA構(gòu)象的影響,試圖從分子水平了解蛋白質(zhì)分子與小分子間相互作用機制,為生命科學研究提供有用的信息.1實驗部分1.1研究對象RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司);PHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠);UV-530型紫外-可見分光光度計(日本JASCO公司);FC-204電子分析天平(上海天平儀器廠);501型超級恒溫器(上海實驗儀器廠).甲硝唑(MET,純品原料藥,由四川樂山長征制藥廠提供)工作液:2.60×10-3mol·L-1;牛血清白蛋白(BSA,上海伯奧生物科技有限公司)溶液:5.20×10-5mol·L-1;NaCl溶液:0.5mol·L-1;pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液.除MET、BSA外,其余試劑均為分析純,實驗用水為二次去離子水,經(jīng)檢驗無熒光雜質(zhì).1.2熒光光譜分析在10mL比色管中依次加入0.5mol·L-1的NaCl溶液2.00mL、BSA溶液2.00mL及一定量的MET工作液,以Tris-HCl緩沖溶液定容為10.0mL用狹縫寬度分別為3nm的RF-5301熒光分光光度計在激發(fā)和發(fā)射光譜,測定一定溫度時BSA及BSA在MET作用下的熒光光譜、同步熒光光譜、共振光散射光譜;用UV-530型紫外-可見分光光度計測定MET的紫外吸收光譜.2結(jié)果和討論2.1光譜特征2.1.1met和bsa的熒光發(fā)射波長對檢測的影響蛋白質(zhì)的熒光猝滅可用于研究藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合信息,當激發(fā)波長為280nm時,蛋白質(zhì)表現(xiàn)的是色氨酸和酪氨酸殘基的熒光.而激發(fā)波長為295nm時,僅僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光.圖2表明了蛋白質(zhì)的熒光強度隨MET濃度的增加而熄滅的過程.在兩種激發(fā)波長下.MET在300-450nm范圍內(nèi)并無熒光,從圖2可見,當MET和BSA發(fā)生作用后,BSA的熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移,且發(fā)射波長紅移的值隨MET濃度的增加而增加,當MET和蛋白質(zhì)的摩爾比達到30.0時,蛋白質(zhì)熒光發(fā)射波長移動了25nm.紅移表明蛋白質(zhì)里的色氨酸殘基被帶到了一個更親水的環(huán)境.2.1.2met對bsa共振光散射光譜的影響圖3為MET對BSA共振光散射光譜的影響由圖3知,隨著MET濃度的增大,其蛋白質(zhì)的共振光散射峰紅移,且發(fā)生共振光散射強度猝滅的現(xiàn)象.2.2甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)的工作特性熒光猝滅通常可分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程:靜態(tài)猝滅過程遵循Lineweaver-Burk方程:其中cQ是猝滅劑的濃度,Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù),KSV為動態(tài)猝滅常數(shù),τ0為猝滅劑不存在時熒光分子壽命.生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s.F0為無猝滅劑時BSA的熒光,F為有猝滅劑時BSA的熒光.KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù).在不同溫度下,用MET作猝滅劑,以343nm處的熒光強度作Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,見圖4.由圖4可見,當藥物和蛋白質(zhì)的摩爾比超過10.5時,動態(tài)猝滅曲線不呈線性關(guān)系,且隨cMET的增加,呈現(xiàn)出向上彎曲的現(xiàn)象.而靜態(tài)猝滅曲線則呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,初步說明MET對蛋白質(zhì)熒光的猝滅過程為靜態(tài)猝滅,為進一步證實其猝滅過程,對圖4a的線性部分及圖4b進行線性擬合,由直線斜率求得猝滅常數(shù)KSV、雙分子猝滅常數(shù)Kq、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB,見表1.在動態(tài)猝滅過程中,一般情況下各類猝滅劑對生物大分子熒光壽命衰減速率影響的Kq值不大于2.00×1010L·mol-1·s-1.因此,甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)的猝滅不是動態(tài)猝滅,而是甲硝唑與蛋白質(zhì)結(jié)合引起的靜態(tài)猝滅.藥物與蛋白質(zhì)之間的相互作用一般采用位點結(jié)合模型來描述,依據(jù)文獻推導出的熒光強度(F)、猝滅劑濃度(cQ)與表觀結(jié)合常數(shù)(KA)及結(jié)合位點數(shù)(n)之間的關(guān)系:以lg(F0-F)/F對lgcQ作圖,MET為猝滅劑,由直線斜率可得298K時,MET與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點數(shù)n=1.06±0.02(曲線的相關(guān)系數(shù)為r=0.9981),表明1分子的甲硝唑和1分子的蛋白質(zhì)結(jié)合.即甲硝唑與BSA作用時具有1個獨立的結(jié)合部位.由直線截距可計算出在298K下甲硝唑與蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)KA=2.22×104L·mol-1.2.3熒光符合譜分析的初步篩選在蛋白質(zhì)溶液中,隨著甲硝唑濃度的增加,其蛋白質(zhì)的共振光散射強度依次降低,這可能是由于甲硝唑在血清白蛋白表面結(jié)合后,破壞了白蛋白表面的保護水層,使原來較為分散的蛋白質(zhì)更加分散,即所謂的解聚作用,引起蛋白質(zhì)粒徑減小,共振散射的截面積減小,導致共振散射強度下降.當反應體系中共振光散射為蛋白質(zhì)產(chǎn)生時,設I0為無猝滅劑時BSA的散射光強度,I為有猝滅劑時BSA的散射光強度,以349nm處散射光強度作Stern-Volmer和Lineweaver-Burk曲線,見圖5.并由圖5可求得猝滅常數(shù)KSV和靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB,見表2.將(3)式用于此體系得出在298K時,甲硝唑與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點數(shù)n=1.10±0.06(曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.9902),甲硝唑與蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)KA=3.48×104L·mol-1.將圖5與圖4相比較可發(fā)現(xiàn),用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程處理散射體系與處理熒光體系得到的結(jié)果非常相似,比較表1和表2,所得猝滅常數(shù)KSV、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB都在相同的數(shù)量級范圍內(nèi).兩種光譜得到的結(jié)合位點數(shù)及表觀結(jié)合常數(shù)也非常接近.說明熒光猝滅理論同樣適合藥物對蛋白質(zhì)共振光散射強度的猝滅.2.4靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)藥物與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等.藥物不同,與蛋白質(zhì)作用力類型不同,當溫度變化不大時,反應焓變ΔH可看作是一常數(shù),由式和表1的靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)可求得MET的ΔrGm、ΔrHm、ΔrSm,見表3.由于ΔrHm>0,ΔrSm>0.從熱力學角度看,MET主要通過疏水作用與BSA發(fā)生結(jié)合反應.2.5臨界能量轉(zhuǎn)移距離通過測定甲硝唑吸收光譜并與BSA發(fā)射光譜比較,發(fā)現(xiàn)兩者有較大部分重疊,如圖6所示,說明兩者之間存在著能量傳遞過程.按照F$rster偶極-偶極無輻射能量轉(zhuǎn)移機理,供能體與受能體之間的結(jié)合距離(r)、臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)及能量轉(zhuǎn)移效率E符合以下關(guān)系:而臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)又與偶極空間取向因子K2,供能體熒光量子產(chǎn)率!、介質(zhì)折射指數(shù)n有關(guān):其中J是供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜的重疊積分F(λ)為熒光供能體在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為受能體在波長λ處的摩爾吸收系數(shù),將圖6中MET的吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜的重疊部分分割成極小的矩形,按式(9)積分,得到J=6.49×10-15cm3·L·mol-1.取向因子取授體-受體各項隨機分布的平均值K2=2/3;BSA中色氨酸殘基的量子產(chǎn)率φ=0.118;折射指數(shù)取水和有機物的平均值n=1.336;由式(8)得到能量轉(zhuǎn)移臨界距離R0=2.28×10-7cm;能量轉(zhuǎn)移效率E由(10)式計算得E=0.124,再根據(jù)(7)式進一步求出MET與BSA的結(jié)合距離r值為3.16nm.2.6甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)同步熒光光譜的影響對于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,Δλ=15nm只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光,Δλ=60nm時只表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光.因為氨基酸殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān),因此由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.圖7為甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)同步熒光光譜的影響,可見酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長基本保持不變,而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長紅移,表明甲硝唑的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化,色氨