細胞內微泡形成的分子機制

囊泡概念和細胞外科醫(yī)生物化學價值一、evs的分類esr是一個由細胞源的雙分子層組成的球形膜層，包括通常提到的微氣泡和外部體。EVs是一組直徑介于40~5000nm間的囊泡狀小體,多種細胞均可向其生存的微環(huán)境中分泌EVs。EVs可攜帶多種生物活性物質,如蛋白酶、各種生長因子及受體、組蛋白、mRNA、miRNA及起源細胞的分子標志等,并把這些生物活性物質由起源細胞轉移至靶細胞。由于EVs是一組異質性較大的群體,因而有很多描述EVs的術語,如外來體、微泡、膜性顆粒、納米顆粒、微粒體、凋亡小體、致癌小體(來源于腫瘤細胞的外來體)、形似外來體的囊泡等。但這些術語易引起歧義,而外來體和微泡正逐漸被廣大學者接受和使用,且歧義較少。目前,依據微泡的不同起源可將EVs分為3種類型,即脫落微泡、外來體和凋亡小體,其各類型的特征詳見(見表1)。目前發(fā)現,多種類型的細胞都能產生EVs,包括各種造血系統(tǒng)的細胞,如血小板、巨核細胞、單核細胞、中性粒細胞、B淋巴細胞和T淋巴細胞,網織紅細胞和肥大細胞等。多種干細胞和前體細胞,如造血干細胞、間充質干細胞、胚胎干細胞、內皮干細胞、腫瘤細胞及多種細胞株在體內、外均可產生微泡。最新研究證實,非造血器官中的上皮和內皮細胞也可分泌EVs,如肺泡上皮細胞。微泡主要存在于細胞生存的微環(huán)境中,目前已能從細胞培養(yǎng)的上清液及各種體液(如血漿、血清、唾液、乳汁和尿液等)中成功分離出EVs。研究發(fā)現,多種機制參與了EVs的形成,脫落囊泡的形成與細胞內鈣離子濃度密切相關,且在脫落囊泡形成的過程中可能有膜受體的參與,進而引起細胞膜的重構和囊泡脫落。外來體的形成不僅依賴胞內鈣離子濃度的變化,還可能與細胞表面各種受體的活化密切相關。在一定條件下,細胞可自發(fā)分泌外來體,如腫瘤細胞株和EBV感染的B淋巴細胞等。刺激EVs形成的其他因素還包括細胞癌性轉化、細胞應激、細胞活化、氧化應激、細胞死亡和(或)凋亡、細胞損傷(如放射損傷)等。二、囊泡在免疫治療中的重要作用EVs所包含的物質與其類型及起源密切相關,因而不同類型和起源的囊泡功能也有所不同。目前研究發(fā)現,EV可在各種生理和病理生理條件下傳遞細胞間信息,即通過傳遞遺傳物質、轉移受體、信號分子等方式影響其他細胞。囊泡在免疫反應、生理穩(wěn)態(tài)維持、血管生成、血栓形成及腫瘤浸潤和轉移等方面具有重要作用。目前,大量研究都試圖通過分析各種生理和病理條件下囊泡發(fā)揮信息傳遞作用的具體分子機制,來闡明其病理生理過程,并期望能將囊泡作為將來治療各種疾病的靶點或早期診斷的生物標志。Grang等的一項研究發(fā)現,腎癌干細胞來源的微泡能促進腫瘤新生血管的形成。Dai等的一項研究已經將腹水來源的微泡用于結腸直腸癌的免疫治療。Mitchell等的研究發(fā)現,根據血流中微泡所含miRNA種類和含量的不同可對特定人群進行早期的腫瘤篩查。evs分離和純化目前已開發(fā)出了很多分離和純化EVs的技術和方法,如差速離心法、蔗糖密度梯度離心法、抗體標記的磁珠分選、微孔過濾技術、ExoQuickTM試劑盒和微流控技術等。但是在目前最大的問題是缺乏標準且高效的EVs分離方法和技術。現有的EVs分離和純化方法在實際應用中均存在較多的缺點和限制。以下主要探討目前EVs的各種分離和純化方法,及每種方法在實際應用過程中的優(yōu)缺點。一、超高速離心目前,差速離心法被認為是分離EVs的標準方法,且已被廣泛用于細胞培養(yǎng)上清液和各種體液中囊泡的分離。盡管不同單位的分離步驟有所差異,但主要有以下幾個步驟。(1)首先是低速離心,一般轉速為300×g,離心10min,此步驟是為了去除細胞。(2)再把上清液高速離心,轉速在(2000~10000)×g間,隨轉速的增加,離心時間可適當縮短,一般為10000×g離心30min,此步驟主要為了去除死亡的細胞和大的細胞碎片。(3)最后為超高速離心,即對前述的上清液進行超高速離心,轉速通常為100000×g,一般離心70min。若想去除蛋白質的干擾得到較高純度的EVs,可在超高速離心后用大量PBS緩沖液重懸,然后重復超高速離心,再棄去上清后用適量PBS緩沖液重懸,即為分離所得的EVs。將其放置到-80℃的冰箱內保存(可保存1年,切忌反復凍融),以備后續(xù)檢測和使用。以上所有離心步驟均在4℃條件下進行。然而,差速離心分離法所需時間較長,一般需要4~5h;且分離過程中需要超高速離心,此步驟對EVs數量影響較大,因而分離得到的EVs的產率較低。此外,該方法分離得到的EVs的純度也較低,?；煊械鞍踪|和核酸碎片等雜質。待分離樣本的黏度也會影響EVs的產率,可將黏度較高的液體進行適當稀釋,然后再按照上述步驟進行分離。雖然分離純化后的EVs數量可在室溫下保持3~4d不變,但一般建議儲存在-80℃冰箱中;反復凍融對EVs活性和數量影響較大,每凍融一次,EVs的數量會損失10%~15%。二、蔗糖分離步驟為去除差速離心法得到EVs中混有的蛋白質和核酸等雜質,可用蔗糖密度梯度離心,其能依據不同物質浮選密度的不同進一步純化EVs。外來體在蔗糖梯度溶液中的浮選密度為1.08~1.22g/mL,而微泡的浮選密度為1.18~1.25g/mL。故可根據需要配置上述不同密度的蔗糖溶液,盡管不同單位的分離步驟有所差異,但主要包括以下幾個步驟。首先是用25mL的PBS緩沖液重懸差速離心法得到的EVs,并加入約4mL適當濃度的蔗糖溶液至離心管中;將EVs稀釋液緩緩加入到蔗糖溶液界面的上方,4℃下進行100000×g高速離心70min;離心結束后,用5mL注射器抽取約3.5mL的蔗糖溶液,并轉移至超速離心管中,并用PBS稀釋至60mL,然后再次離心,4℃下100000×g離心70min;最后棄去上清液,并用50~100μL的PBS液重懸,所得即為EVs。三、差速離心法微孔過濾技術是近年剛開發(fā)的一項分離EVs的新技術。常與差速離心法配合使用,用于取代差速離心法中前兩步的離心步驟,其作用也是為了清除死亡細胞、較大的細胞碎片和凋亡顆粒。雖然微孔分離技術與差速離心聯合能縮短EVs分離所需時間,但該方法會降低EVs的產率,且分得EVs中混有較多的蛋白質雜質。四、胞來源的evs分離關于EVs蛋白質組學的研究發(fā)現,EVs可表達一些囊泡共有蛋白和細胞特異性的蛋白,而這些蛋白可作為分子標志用于EVs的分離。目前,使用抗體包被的免疫磁珠已能成功分離多種細胞來源的EVs,其分離方法主要包括以下幾個步驟。首先把待測樣本(一般為2mL)與標記目標EV抗體的免疫磁珠(一般約50μL)混勻,在室溫下置于搖床上孵育2h;再把分離柱放到分離器的磁鐵架上,并用500μL的PBS潤洗分離柱;然后將孵育結束后的待分離樣本緩緩加入到分離柱中,棄去廢液;將分離柱移出磁性分離器;最后用PBS沖洗分離柱,收集沖洗分離柱所得到的液體,即為含有目標EVs的液體。但用此方法分離得到的EVs活性受到一定影響,不利于后續(xù)的EVs的功能分析和研究,且不適用于大體積樣本的分離。五、微流控裝置工作原理微流控技術是一種在微觀領域研究和操控液體流動的技術。這種微流控技術和微型化的芯片裝置對于臨床診斷和血液分析非常有用。微流控裝置可利用EVs與抗體包被界面的特異性結合來分離EVs,將待測樣本加入裝置后,裝置內微型泵促使液體流過芯片,在流動過程中達到分離EV的目的。使用此技術的設備結構復雜,具體詳細步驟不再論述。該分離EVs的方法具有快捷、省時、高效的特點,但不適合體積較大樣本的分離,一般每小時僅能分離400~500μL樣本。六、誤吸分離試驗目前,許多國際知名的生物科技公司都在競相開發(fā)能從各種體液中快速、簡單地分離EVs的方法。目前最成熟的是由美國Biosciences公司生產的ExoQuickTM試劑盒。使用此試劑盒能夠克服差速離心法耗時較長和所得EVs純度低的缺點。Taylor等分析并比較了各種EVs分離的方法,發(fā)現使用ExoQuickTM試劑盒分離得到的EVs中所含miRNA的純度和數量要高于其他方法。但目前仍需進一步研究以證實此類試劑盒的適用性。evs的分離與純化目前對于EVs研究有了一些進展,對微泡的起源、組分及其部分功能有了初步了解,微泡在疾病診斷和治療方面的作用已嶄露頭角。Fleitas等的一項研究發(fā)現,血流中的微泡和內皮細胞可作為判斷終末期非小細胞肺癌預后指標。Rank等的研究發(fā)現,血漿中紅細胞來源的微泡有助于異基因造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病的診斷。Cantalupp等的一項研究發(fā)現,內皮前體細胞來源的微泡有助于保護腎臟的缺血再灌注損傷。在中風動物模型研究中發(fā)現,間充質干細胞來源的囊