蔗糖密度梯度離心法和差速離心法提取的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外體的比較

間充質(zhì)干細(xì)胞（msc）的存在對損傷恢復(fù)的影響日益受到關(guān)注。本課題組的前期研究表明,人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外體(hucMSC-Ex)能修復(fù)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化以及順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷,但究竟何種蛋白質(zhì)成分起關(guān)鍵作用尚不清楚。近年來,用質(zhì)譜法對外體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的技術(shù)已得到飛速發(fā)展,為了得到準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果,要求樣品必須有較高的純度和濃度。研究表明,許多高豐度蛋白質(zhì)的存在必然會(huì)干擾一些功能性小分子蛋白質(zhì)的分離和鑒定,因此,通過改進(jìn)提取方法以獲得更純的hucMSC-Ex具有重要意義。本研究主要對常用的蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾超速離心法(以下簡稱蔗糖密度梯度離心法)和差速離心法提取的hucMSC-Ex進(jìn)行比較,旨在為hucMSC-Ex的基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1免疫、定量分析試劑人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(EA.hy926)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司),無血清培養(yǎng)基(上海依科賽公司),重水(D2O,上海創(chuàng)賽公司),分析純蔗糖(廣州化學(xué)試劑廠),兔抗人CD9抗體(美國BioworldTechnology公司),兔抗人CD81抗體(美國Epitomics公司),BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(北京康為世紀(jì)公司),預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物、100-kDaMWCO超濾離心管、0.22μm無菌濾膜(美國Millipore公司),氯甲基苯甲酰氨熒光染料(CM-DiI,美國MolecularProbes公司),hoechst33342染料(美國Sigma公司);超速冷凍離心機(jī)(OptimaL-90K,美國BeckmanCoulter公司),透射電子顯微鏡(FEITecnai12,Philips公司),全自動(dòng)凝膠成像儀(北京賽智公司),二氧化碳培養(yǎng)箱、高內(nèi)涵分析儀(美國ThermoScientific公司)。1.2hummc的分離和訓(xùn)練采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法分離培養(yǎng)及鑒定hucMSC,分離出的hucMSC于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。1.3外體分離和外體分離選擇生長狀態(tài)良好的3~5代hucMSC用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞融合至70%~80%時(shí)換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),48h后收集培養(yǎng)上清液,300×g離心10min以去除漂浮的活細(xì)胞,用于外體的分離。1.4hummc-ex分離1.4.1蔗糖/重水質(zhì)糖液的濃縮參照Zhu等的方法并加以改進(jìn)。將收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g離心10min,以去除細(xì)胞碎片;收集上清后于4℃、10000×g離心30min,以去除細(xì)胞器;將上清液轉(zhuǎn)移至100-kDaMWCO超濾離心管,4℃、1000×g離心30min進(jìn)行濃縮;將濃縮液緩慢移至5mL30%蔗糖/重水密度墊(ρ=1.210g/cm3),4℃、100000×g離心3h;收集底部5mL蔗糖/重水層(含外體),用PBS稀釋后加入100-kDaMWCO超濾離心管中,4℃、1000×g離心30min,PBS洗滌3次;最后用0.22μm無菌濾膜過濾除菌,分裝后于-70℃保存,并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測。1.4.2離心液的制備參照Clotilde等方法,將收集的hucMSC上清液于4℃、2000×g離心10min,以去除細(xì)胞碎片;收集上清液后于4℃、10000×g離心30min,以去除細(xì)胞器;將上清液用0.22μm無菌濾膜過濾除菌后直接置4℃、100000×g離心3h;棄上清液,沉淀用無菌PBS重懸后,置4℃、100000×g離心3h;棄上清液,沉淀用無菌PBS重懸,分裝后于-70℃保存,并用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測。1.5銅網(wǎng)透射電鏡sem觀察取上述兩種方法提取的hucMSC-Ex各20μL,充分混勻后滴加于直徑2mm的載樣銅網(wǎng)上,于室溫靜置5min后,用濾紙輕輕吸去銅網(wǎng)邊緣殘余液體,然后將銅網(wǎng)倒扣于30g/L磷鎢酸(pH6.8)液滴上,室溫下負(fù)染5min,最后將銅網(wǎng)在白熾燈下烘干,置于透射電鏡下觀察并拍照。1.6s-東南角電泳將上述兩種方法提取的hucMSC-Ex用15%SDS電泳(80V,90min)分離,取出分離膠,用2.5g/L考馬斯亮藍(lán)R-250染色,沸水快速脫色后經(jīng)全自動(dòng)凝膠成像儀掃描圖像并分析。1.7免疫兔抗人cd9和cd81的表達(dá)配制15%SDS電泳膠,將上述兩種方法提取的hucMSC-Ex充分裂解后加入1/4體積的5×SDS上樣緩沖液,煮沸5min,按200μg蛋白質(zhì)總量上樣,將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印(350mA,120min)至PVDF膜上,用含50g/L脫脂牛奶的TBS/0.5%Tween20室溫封閉1h,分別與兔抗人CD9抗體(1∶500稀釋)和兔抗人CD81抗體(1∶500稀釋)于4℃反應(yīng)過夜,次日用TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗37℃溫育1h,TBS/0.5%Tween20洗膜3次后,加入預(yù)混HRP化學(xué)發(fā)光底物,并用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。1.8細(xì)胞表型的制備用親脂性紅色熒光染料CM-DiI按5μL/mL的比例加入上述兩種方法提取的hucMSC-Ex中,充分混勻后于37℃避光溫育30min,然后轉(zhuǎn)移至100-kDaMWCO超濾離心管,并加入10倍體積的PBS,4℃、1000×g離心30min以洗去未與hucMSC-Ex結(jié)合的染料,最終將濃縮液分別加入臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926中,37℃溫育4h后,PBS洗滌2次,再用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20min,hoechst33342(1∶200稀釋)染細(xì)胞核10min,高內(nèi)涵分析儀上觀察并拍照。2結(jié)果2.1膜性囊泡結(jié)構(gòu)透射電鏡下可見兩種方法提取的hucMSC-Ex均具有典型的圓形或橢圓形的膜性囊泡結(jié)構(gòu),直徑約為30~100nm,腔內(nèi)為低電子密度成分(圖1)。2.2差速離心法分離細(xì)胞外解蛋白的檢測SDS和westernblot檢測結(jié)果顯示,兩種方法提取的hucMSC-Ex內(nèi)均含有多種蛋白質(zhì)成分,并且均表達(dá)外體的標(biāo)志蛋白CD9和CD81(圖2A),而差速離心法中經(jīng)2000×g處理的沉淀(即細(xì)胞碎片)和100000×g處理的上清液(去除外體成分)均未檢測出外體的標(biāo)志蛋白(圖2B)。相同濃度條件下,差速離心法提取的hucMSC-Ex其表面標(biāo)志比蔗糖密度梯度離心法表達(dá)更強(qiáng),但高豐度蛋白質(zhì)(Mr:55000~70000)含量卻明顯低于蔗糖密度梯度離心法(圖2A),從圖2B中可見100000×g處理的上清液中含有大量高豐度蛋白質(zhì),可以推測這些高豐度蛋白質(zhì)主要來源于無血清培養(yǎng)基的污染。2.3標(biāo)記和內(nèi)部控制3不同分離方法的比較外體是一種由胞內(nèi)多胞體(multivebodies,MVB)與胞膜融合后分泌到細(xì)胞外環(huán)境中的膜性小囊泡,其主要特征有:(1)直徑約30~100nm;(2)密度為1.13~1.19g/cm3;(3)具有來源細(xì)胞胞質(zhì)、胞膜成分以及外體相關(guān)標(biāo)志性蛋白,如CD9、CD81等,在細(xì)胞與細(xì)胞間通訊中起到非常重要的作用。研究表明,MSC來源的外體能有效改善心肌缺血/再灌注損傷以及急、慢性腎損傷和肝纖維化。因此,有望成為一種新的非細(xì)胞成分用于組織損傷的修復(fù)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)外體的蛋白質(zhì)組成比較復(fù)雜,且不同細(xì)胞來源的外體其蛋白質(zhì)組成亦有較大差異,這賦予了外體復(fù)雜的生物學(xué)功能。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中,高豐度蛋白質(zhì)的存在會(huì)掩蓋很多功能性小分子蛋白質(zhì)的檢出,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成嚴(yán)重干擾,所以,我們的樣品必須符合純度高、高豐度蛋白質(zhì)含量盡可能少的標(biāo)準(zhǔn),此外,還要考慮操作簡便,成本低廉等實(shí)際因素。因此,尋找符合上述條件的提取外體的方法非常重要。目前,去除高豐度蛋白質(zhì)的方法主要有免疫親和層析法、有機(jī)溶劑沉淀法和超濾離心法等。免疫親和層析法的去除專一性強(qiáng)、去除效率高,一次可以去除多種高豐度蛋白質(zhì),但該方法成本較高,且操作繁瑣;有機(jī)溶劑沉淀法雖然成本低廉、操作簡單,但是有機(jī)溶劑在沉淀高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)會(huì)將部分低豐度蛋白質(zhì)一同沉淀下來,因此特異性不高;超濾離心法可根據(jù)高豐度蛋白質(zhì)的分子量選擇合適的MWCO超濾膜,并借助離心力作用有效去除高豐度蛋白質(zhì),但是該法在截留高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)還會(huì)截留某些分子量大于高豐度蛋白質(zhì)的功能性蛋白質(zhì)。由此觀之,以上方法在去除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)都或多或少導(dǎo)致部分功能性低豐度蛋白質(zhì)的丟失,都不適用于外體中高豐度蛋白質(zhì)的去除。外體是活細(xì)胞分泌的一種多因子復(fù)合體,研究表明,超高速(100000×g)離心能夠有效的將外體分離沉淀,利用外體的這一特點(diǎn)可以將其與培養(yǎng)上清液中其他可溶性蛋白質(zhì)有效地分離,因此,比較外體不同提取方法具有重要意義。本研究中,我們分別用蔗糖密度梯度離心法和差速離心法成功提取了hucMSC-Ex,發(fā)現(xiàn)在相同蛋白質(zhì)濃度下,差速離心法提取的hucMSC-Ex其表面標(biāo)志物的表達(dá)量明顯強(qiáng)于蔗糖密度梯度離心法,相同時(shí)間內(nèi)外體進(jìn)入靶細(xì)胞的數(shù)量也明顯多于蔗糖密度梯度離心法,但高豐度蛋白質(zhì)含量卻大大降低,說明差速離心法提取的hucMSC-Ex較蔗糖密度梯度離心法更純,相同作用時(shí)間內(nèi)前者在靶細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)也有可能更強(qiáng),因此,在進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)時(shí)差速離心法提取的hucMSC-Ex的作用效果更具有代表性。綜上所述,差速離心法既能最大限度地去除不需要研究的高豐度蛋白質(zhì),同時(shí)又不影響外體的生物學(xué)活性及其包含的功能性低豐度蛋白質(zhì)的含量,且操作簡便、成本低廉、重復(fù)性好,不僅可以滿