星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化連錢草總黃酮提取工藝

本實驗與紫外分光光度法相結(jié)合，利用效應(yīng)優(yōu)化法（srm）對連銀草中總黃酮進(jìn)行了優(yōu)化，并采用了非線性數(shù)學(xué)模型調(diào)整方法，將自變量與因變量的關(guān)系擴展到曲線，使實驗數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，比傳統(tǒng)的正交分析法更可靠。1材料表面1.1儀器UV-752型紫外-可見分光光度計;FA-1104型電子分析天平;KH-500B型超聲波清洗儀;FW100型高速萬能粉碎機。1.2其他試劑鑒定蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:080-9303);水為蒸餾水;其他試劑均為分析純。連錢草藥材,采于江蘇及其周邊地區(qū),經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥系藥用植物教研室炮制教研室巢建國教授鑒定為唇形科植物活血丹Glechomalongituba(Nakai)Kupr.的地上部分。粉碎,備用。2方法和結(jié)果2.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品22.85mg,置于100mL量瓶中,加甲醇約60mL,密塞,超聲使其溶解,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,得蘆丁對照品溶液(即每mL溶液中含蘆丁對照品為0.2285mg)。2.2超聲提取法取連錢草粉末約0.5g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入55%甲醇40mL,密塞,稱定質(zhì)量,室溫下超聲提取(功率250W,100kHz)90min,放冷,補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。2.3紫外-可見分光光度法分別精密吸取上述供試品溶液2mL和蘆丁對照品溶液2mL,置25mL量瓶中,加水至6mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,加入氫氧化鈉試液10mL,再加水至刻度,搖勻,放置15min,分別作為供試品溶液和對照品溶液,并以相應(yīng)的試劑為空白,照紫外-可見分光光度法(《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄VA),于200～800nm掃描,結(jié)果在510nm處有最大吸收,故以510nm為測定波長。2.4方法研究2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取上述蘆丁對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分別置于25mL量瓶中,各加水至6mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,加10%硝酸鋁溶液1mL,搖勻,放置6min,加入氫氧化鈉試液10mL,再加水至刻度,搖勻,放置15min,以相應(yīng)的試劑為空白,在510nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=11.27C+0.001(r=0.9995),式中A代表吸光度,C代表對照品濃度(mg/mL),對照品濃度在0.00914～0.05484mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.4.2測定的精密度試驗取濃度為0.03656mg/mL的對照品溶液,連續(xù)測定6次,對照品溶液吸光度平均值為0.416,RSD為0.13%,表明測定方法的精密度良好。2.4.3供試品溶液穩(wěn)定性精密吸取同一份供試品溶液2mL,置于25mL量瓶中,照2.4.1項下的顯色方法處理樣品,于510nm測定吸光度,每間隔5min測定1次,在30min內(nèi),吸光度平均值為0.423,RSD為0.81%,說明供試品溶液在30min內(nèi)顯色穩(wěn)定。2.4.4重復(fù)性測定結(jié)果取同一批次連錢草粉末,制得6份供試品溶液,于510nm依法測定吸光度并計算出連錢草中總黃酮的平均含量為36.49mg/g,RSD為1.12%,表明該方法的重復(fù)性良好。2.4.5加樣回收及加樣回收率取已知含量連錢草粉末6份,每份約0.2g,精密稱定,分別置于錐形瓶中,各加入新鮮配制的蘆丁對照品溶液(濃度為1.425mg/mL)5mL,按2.2項下供試品溶液的制備方法制備樣品,于510nm處依法測定吸光度,計算加樣回收率,結(jié)果平均加樣回收率為99.32%,RSD為2.38%。2.5sd-sd-優(yōu)化了總黃酮提取工藝，包括金草中的總黃酮2.5.1提取溶劑的選擇按2.2項下供試品溶液的制備方法提取連錢草中總黃酮,其中影響提取效果的可能因素較多。為了便于操作和保證實驗精度,以連錢草總黃酮的含量為指標(biāo),采用單因素試驗,比較了超聲法、加熱回流法及滲漉法的提取效率和操作步驟的繁易程度,最后決定采用超聲提取法;在溶劑的選用上,水、甲醇、乙醇均是提取黃酮類成分的常用溶劑,尤其是甲醇,提取效果較佳。(本實驗從驗證星點設(shè)計實驗的準(zhǔn)確性出發(fā),故而選之,并未考慮到工業(yè)化生產(chǎn),可以考慮用乙醇做替代實驗。)進(jìn)而分別對甲醇的濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%),超聲提取的時間(20、40、60、120、180min),超聲次數(shù)(1、2、3、4次)以及溶劑的用量(30、40、50mL)這些因素進(jìn)行了考察。實驗發(fā)現(xiàn),60%的甲醇具有最佳提取效果,超聲時間在60min及120min時提取總黃酮含量最多,溶劑的用量以40mL為宜,其他因素的影響作用較弱,暫不予考慮。2.5.2次多項式擬合根據(jù)單因素考察結(jié)果,選擇提取工藝中對總黃酮含量有影響的3個主要因素為考察對象,即甲醇濃度(X1)、超聲時間(X2)及溶劑用量(X3),同時以連錢草中總黃酮的含量(Y)為評價指標(biāo)。根據(jù)CCD的原理,每個因素取5個水平,因素和水平見表1,實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。以連錢草中總黃酮的含量(Y)為因變量,使用Statistica7.0軟件,分別對X1,X2,X3進(jìn)行多元線性回歸和二次多項式回歸擬合,結(jié)果如下:多元線性回歸方程:Y=46.99918-0.36283X1+0.03892X2+0.010319X3,r=0.9217;二元多項式方程:Y=-12.2371+1.2193X1-0.0104X12+0.0561X2-0.0003X22+0.6006X3-0.0053X32-0.0007X1X2-0.0045X1X3+0.0020X2X3,r=0.9829。由結(jié)果可知,二次多項式擬合的相關(guān)系數(shù)優(yōu)于多元線性回歸方程,因此本實驗以二次多項式為其數(shù)學(xué)模型。由于三維圖只能表示效應(yīng)對其中2個因素的關(guān)系,為了考察各因素對指標(biāo)的影響,先固定一個對應(yīng)變量影響最小的自變量,觀察可知,X3對應(yīng)變量Y的影響最小,一般設(shè)其值為中值,因此,選擇X3為40,代入二次多項式方程,繪制因變量Y對X1(甲醇濃度)和X2(超聲時間)的3D效應(yīng)面圖(A)和等高線圖(B),見圖1。根據(jù)以上效應(yīng)面圖和等高線圖直觀分析,當(dāng)溶劑用量(X3)一定時,甲醇濃度(X1)在40%～60%之間,超聲時間(X2)在80～150min時連錢草中總黃酮的提取含量達(dá)到最大。2.6預(yù)測結(jié)果的驗證根據(jù)得到的最優(yōu)條件,結(jié)合單因素考察結(jié)果和實際可操作性,確定連錢草總黃酮的最優(yōu)提取條件為:甲醇濃度為55%,超聲時間為90min,溶劑用量為藥材量的8倍(本實驗為40mL),代入二項式方程得到連錢草總黃酮含量的預(yù)測值為35.36mg/g。在此條件下提取連錢草藥材,依法測定其總黃酮含量,對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示,3批連錢草藥材總黃酮的平均含量為35.66mg/g,預(yù)測值與實際值之間偏差較小,本實驗確定的最佳提取工藝條件合理,且具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。3系統(tǒng)成分篩選實驗?zāi)壳皣鴥?nèi)多采用單因素考察或正交設(shè)計法優(yōu)化中藥有效成分的提取純化等工藝,雖然以上方法較為簡便,但精度不高,而且大多情況下,各因素對效應(yīng)的影響并非線性,實驗數(shù)據(jù)沒有可靠的預(yù)測性。就傳統(tǒng)的正交設(shè)計法而言,雖然實驗次數(shù)較少,但由于因素之間交叉的不夠全面而導(dǎo)致實驗結(jié)果與單純的單因素考察結(jié)果存在偏差。本實驗采用CCD