pen、p-ak和p-erk在膽脂瘤中的表達(dá)及其相關(guān)性

中耳膽脂瘤（midleaf）是耳科領(lǐng)域最受關(guān)注的常見疾病。它的特點是青少年聽力疾病，那里有高度克隆鱗狀上皮和鄰近骨骼的破壞。目前對膽脂瘤的研究集中在上皮細(xì)胞增殖與凋亡的分子生物學(xué)水平這兩個方面。蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen,PTEN)是一種新的腫瘤抑制基因,隨著研究的深入,人們對其作用的認(rèn)識也發(fā)生了很大改變。過去認(rèn)為PTEN絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì),現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和核中都存在;過去認(rèn)為PTEN的作用是單一的,現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白的亞細(xì)胞定位不同,其作用也不盡相同〔１－２〕。目前還沒有對中耳膽脂瘤中不同定位PTEN的研究。本文應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法和Westernblot免疫印跡法,定位、定量檢測中耳膽脂瘤及正常皮膚中PTEN、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(P-ERK)的表達(dá),分析它們之間的相關(guān)性,探討其在中耳膽脂瘤形成機(jī)制中所起的作用,從細(xì)胞增殖和凋亡兩個方面解釋中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。1皮膚損傷的皮膚組收集2011-01-2011-09在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科手術(shù)的中耳膽脂瘤標(biāo)本40例,同時收集耳廓腫物切除術(shù)安全緣處皮膚或修補(bǔ)術(shù)中廢棄及不能使用的耳后正常皮膚碎塊15例作為對照組。用其中20例中耳膽脂瘤標(biāo)本和10例正常皮膚標(biāo)本行Westernblot免疫印跡法檢測。1.2免疫印跡法檢測免疫反應(yīng)中表達(dá)陽性樣品及檢測結(jié)果評判1.2.1免疫組織化學(xué)實驗所取標(biāo)本于手術(shù)后立即甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋,作4μm厚的連續(xù)切片,經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師閱片證實無誤。每個標(biāo)本切片3張,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,操作步驟嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書進(jìn)行。用已知陽性切片作為陽性對照,以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。本實驗主要采用北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒,主要染色步驟如下:1將石蠟切片植入60℃烤箱1h;2二甲苯脫蠟兩次,每次20min;3無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇下行梯度乙醇水化,各5min;4蒸餾水沖洗,PBS液中浸泡5min;53%過氧化氫去離子水孵育10min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS沖洗3次,每次3min;6抗原修復(fù),采取胃蛋白酶行酶修復(fù)法行抗原修復(fù)20min,之后PBS沖洗3次,每次3min;7滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫孵育10min,傾去,勿洗;8滴加適當(dāng)比例的一抗,4℃冰箱內(nèi)過夜;9PBS沖洗3次,每次3min;10滴加試劑B(生物素化二抗工作液),室溫或37℃孵育10~15min,PBS沖洗3次,每次3min;11滴加試劑C辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液),室溫或37℃孵育10~15min,PBS沖洗3次,每次3min;12滴加新鮮配制的DAB顯色液,在顯微鏡下控制背景,顯色約3min左右;13用自來水充分沖洗,蘇木精復(fù)染半分鐘,蒸餾水沖洗,自來水返藍(lán)30min;14行梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片;15觀察和照相,100倍、200倍及400倍顯微鏡下觀察顯色情況并照相,每張片在400倍顯微鏡下隨機(jī)取5個不重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),計算陽性細(xì)胞所占比例。上述步驟中用己知陽性切片作為陽性對照,用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照,以排除非特異性著色。結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn):將膽脂瘤上皮和正常皮膚上皮層分為基底層(basallayer)、基底上細(xì)胞層(suprabasallayer)和表層即角質(zhì)層(upperlayer)。細(xì)胞核或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。在陽性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上,綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)兩個方面進(jìn)行分析。1先按染色強(qiáng)度計分:0分為沒有染色,1分為微弱棕黃色,2分為中等強(qiáng)度棕黃色,3分為深棕色;2然后每張400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個不重疊視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù),每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,計算5個視野的陽性細(xì)胞的平均百分比,按照百分比計分:沒有細(xì)胞著色為0分,<20%細(xì)胞著色為1分,21%~50%細(xì)胞著色為2分,>50%細(xì)胞著色為3分;3最后將染色強(qiáng)度計分和百分比計分相乘之積作為該樣本評判標(biāo)準(zhǔn),得分為0~2分者為陰性樣本(-),3分或以上者為陽性樣本(+)。1.2.2Westernblot免疫印跡法檢測各個目的蛋白的表達(dá)1提取蛋白方法:將少量組織塊(100mg左右)置于1~2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。加400μl單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中,進(jìn)行勻漿,然后置于冰上。幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。裂解30min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在4℃下12000r/min離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。用時取出,直接溶解上樣。2電泳:根據(jù)目的蛋白的分子量,配制10%SDS膠垂直電泳,根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量,保持每孔40μg蛋白上樣,先采用電壓90V,1h濃縮樣品蛋白,再采用電壓120V,90min電泳分離樣品蛋白。3轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后,PVDF膜先后要在100%甲醇里浸泡10min、去離子水中浸泡20min,接著將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜一起放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min,按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”依次順序裝好轉(zhuǎn)膜裝置(膜靠正電極一邊),按恒壓100V電轉(zhuǎn)移120min到PVDF膜上。4封閉和一抗孵育:用5%脫脂奶粉常溫下封閉搖床1h,PBS液洗膜3次,每次15min,然后加入按說明書要求稀釋的PTEN、P-AKT、P-ERK和內(nèi)參GAPDH抗體,于4℃孵育過夜。5二抗孵育:TBST液洗膜3次,每次15min,加入二抗,室溫下?lián)u床1h。6顯影:TBST液洗膜3次,每次15min,用ECL顯色液顯色,定影液終止顯色。7各實驗重復(fù)3次。1.3異比較及計量資料的比較應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,計數(shù)資料的差異比較采用χ２檢驗,計量資料的差異比較用兩樣本t檢驗,運用Spearman檢驗來判斷PTEN、P-AKT和P-ERK蛋白表達(dá)之間的相互關(guān)系(相關(guān)性分析),以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1中耳膽脂瘤p-akt表達(dá)情況核PTEN在膽脂瘤和正常皮膚的上皮層細(xì)胞核著色,以基底層和基底上細(xì)胞層為主。15例正常皮膚中10例為陽性標(biāo)本(圖1);40例中耳膽脂瘤標(biāo)本中有11例為陽性標(biāo)本(圖2)。PBS緩沖液代替一抗的陰性對照片不著色。中耳膽脂瘤標(biāo)本陽性率為27.5%,正常皮膚陽性率為66.7%,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);質(zhì)PTEN在膽脂瘤和正常皮膚的上皮層細(xì)胞質(zhì)著色,以基底層和基底上細(xì)胞層為主。15例正常皮膚中13例為陽性標(biāo)本(圖1);40例中耳膽脂瘤標(biāo)本中有21例為陽性標(biāo)本(圖2)。PBS緩沖液代替一抗的陰性對照片不著色。中耳膽脂瘤標(biāo)本陽性率為52.5%,正常皮膚陽性率為86.6%,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);P-AKT在膽脂瘤和正常皮膚的上皮基底層和基底上細(xì)胞層胞質(zhì)中著色,有時亦伴有胞核著色。15例正常皮膚中有4例為陽性標(biāo)本(圖3),陽性率為26.7%,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。40例中耳膽脂瘤標(biāo)本中有29例為陽性標(biāo)本(圖4),陽性率為72.5%;P-ERK染色主要位于細(xì)胞核,15例正常皮膚中有4例為陽性標(biāo)本(圖5),陽性率為26.6%;40例中耳膽脂瘤標(biāo)本中有33例為陽性標(biāo)本(圖6),陽性率為82.5%,分布于膽脂瘤上皮全層,兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。PTEN,P-AKT和P-ERK蛋白表達(dá)相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)分析得出,中耳膽脂瘤中質(zhì)PTEN與P-AKT蛋白陽性表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=0.558,P<0.01);核PTEN與P-ERK蛋白陽性表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.569,P<0.01)。Westernblot免疫印跡法顯示:PTEN蛋白在中耳膽脂瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯少于正常皮膚,P-ERK、P-AKT在中耳膽脂瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯多于正常皮膚(圖7)。本實驗重復(fù)3次。三種蛋白在中耳膽脂瘤與正常皮膚的相對灰度值行兩樣本t檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。3pten的功能目前人們對膽脂瘤發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,主要集中在上皮細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞凋亡和骨質(zhì)破壞吸收等方面,但其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。首先明確兩個概念:細(xì)胞增殖(cellproliferation)是通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞數(shù)量的過程;細(xì)胞凋亡(ap-optosis)又稱細(xì)胞程序性死亡(programmedcelldeath),是由基因調(diào)控引發(fā)的,細(xì)胞在一定的生理或病理條件下遵循自身的程序,自我結(jié)束生命的死亡方式?？梢?細(xì)胞增殖與細(xì)胞抗凋亡不是一個意思,所以之前有一些學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡受到抑制就是促進(jìn)增殖或細(xì)胞增殖受抑制就是促進(jìn)凋亡,缺乏進(jìn)一步的解釋。國內(nèi)外對中耳膽脂瘤上皮的增殖與凋亡做了大量研究,目前普遍認(rèn)為膽脂瘤囊壁的復(fù)層鱗狀上皮高度增殖與膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但具體的機(jī)制還未完全清楚。而關(guān)于膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡研究,學(xué)者們的意見并不一致。目前有兩種不同觀點:其一認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞凋亡增強(qiáng)〔３－４〕,另一認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞凋亡受抑制〔５－６〕,即抗凋亡(antiapoptosis)。本實驗從細(xì)胞增殖和凋亡兩個方面研究PTEN及其下游蛋白在中耳膽脂瘤形成過程中所起的作用,期望有助于解釋中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制,為其預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。PTEN是最早發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因,能夠維持正常的物質(zhì)代謝和內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài),大量研究證實:PTEN基因在多條信號通路的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重要作用,影響靶分子及其下游的信號級聯(lián)反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理活動。最早對PTEN的研究多報道PTEN位于胞質(zhì)中,而后大量研究表明PTEN不僅存在于胞質(zhì)還存在于胞核中,因為早期研究多集中在腫瘤細(xì)胞,而大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中核PTEN都是缺失的〔７－８〕。之后許多實驗〔８－９〕證明,在正常的靜態(tài)組織中PTEN主要定位在細(xì)胞核。隨著PTEN蛋白胞核胞質(zhì)穿梭現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)〔１０－１１〕,越來越多的人認(rèn)為核PTEN與質(zhì)PTEN的作用不盡相同〔２〕。核PTEN承擔(dān)抑制細(xì)胞增殖的功能〔１０－１２〕。有報道顯示核PTEN可以抑制ERK激活,從而對ERK信號途徑起負(fù)調(diào)節(jié)作用〔１３〕。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)家族成員之一,是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的重要成分,磷酸化的ERK由胞質(zhì)向胞核傳遞,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、分裂、死亡等多種生理過程,并在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用〔１４〕。ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至少通過3條途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖〔１５〕,即通過磷酸化氨甲?；姿岷铣擅涪蚣ぐl(fā)DNA合成;通過MAPK活化的蛋白激酶促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展;通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性間接促進(jìn)細(xì)胞的生長。MAPK在細(xì)胞周期中還可能是調(diào)節(jié)微管組織中心(microtubuleorganizingcenters,MTOC),因為在轉(zhuǎn)位期MAPK可被激活并且與MTOC相關(guān)活化的ERK1/2在M期與MTOC結(jié)合,調(diào)節(jié)MTOC的功能。在G1/S轉(zhuǎn)變期,活化的ERK1/2能通過FOS家族和myc誘導(dǎo)cyclinD1的表達(dá),同時調(diào)節(jié)cyclin/CDK復(fù)合物的形成;在G2/M轉(zhuǎn)變期,活化的ERK1/2參與了cy-clinB1轉(zhuǎn)運入胞核。通過上述途徑,ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展,最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖〔１６-１７〕。而提到質(zhì)PTEN的功能,過去研究者發(fā)現(xiàn)PTEN絕大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中,自從發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核也存在PTEN蛋白后,人們才有意識地區(qū)分核質(zhì)PTEN的不同作用。所以之前對PTEN的研究結(jié)果不能籠統(tǒng)地認(rèn)為就是質(zhì)PTEN的作用。目前認(rèn)為質(zhì)PTEN最主要的功能就是下調(diào)PI3K/AKT通路和上調(diào)〔p27Kip11〕。相關(guān)報道顯示細(xì)胞的P-AKT蛋白水平下降與增加該細(xì)胞中表達(dá)野生型PTEN蛋白密切相關(guān)。PTEN能使PIP3脫磷酸,來維持PIP3的低水平,從而下調(diào)PI3K/AKT通路。PTEN的失活必然導(dǎo)致PI3K/AKT通路活化〔18〕,活化的AKT是細(xì)胞存活因子,能通過多種途徑降低凋亡因子與增加抗凋亡蛋白的活性〔11,19〕。至今國內(nèi)外對PTEN/ERK通路在中耳膽脂瘤所起的作用研究甚少,Huisman等〔２０－２１〕利用免疫組織化學(xué)方法檢測出P-ERK在中耳膽脂瘤中的表達(dá)明顯多于正常皮膚組織,但并沒有檢測PTEN的表達(dá)變化;而對PTEN/AKT通路在中耳膽脂瘤所起的作用研究不多,Yune等〔２２〕利用免疫組織化學(xué)方法檢測出P-AKT在中耳膽脂瘤中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織,并檢測膽脂瘤中PTEN的表達(dá)低于正常皮膚組織,兩者呈負(fù)相關(guān)。但沒有進(jìn)一步分析與核、質(zhì)PTEN的相關(guān)性。本實驗利用不同亞細(xì)胞定位的PTEN功能不同這一特點,從細(xì)胞增殖和凋亡兩個方面研究PTEN及其下游蛋白在中耳膽脂瘤形成過程中所起的作用。結(jié)果表明中耳膽脂瘤中總PTEN蛋白(核PTEN加質(zhì)PTEN)的表達(dá)量少于正常皮膚中總PTEN蛋白的表達(dá),其中核PTEN、質(zhì)PTEN的表達(dá)也分別少于