實時熒光定量pcr技術在基因表達分析中的應用

柳樹是柳樹科植物落葉樹的總稱。它具有生長短、適應性強、分布廣、易推廣、無性繁殖等特點。這是一個重要的經濟因素。楊樹木材可以用來生產家具、火柴梗、鋸材、建筑材、人造板及纖維用品等。近幾年來,隨著世界能源的消耗,楊樹木材作為一種潛在的生物新能源的來源備受關注。毛果楊(Populustrichocarpa)是一種重要的楊樹。隨著其全基因組的解碼,它已成為繼擬南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻(Oryzasativa)之后的第3種植物學研究的模式植物。有關毛果楊基因功能的研究方興未艾。最常用的檢測基因表達水平的方法有DNA微陣列(DNAmicroarray)、Northern印跡(northernblot)、原位雜交(insituhybridization,ISH)和實時定量PCR(quantitativereal-timepolymerasechain,qRT-PCR)等。其中,qRT-PCR是定量分析mRNA表達中最通用、最快速且最簡單的方法,具有高靈敏性和特異性,已被廣泛應用于分子醫(yī)學、生物科學、微生物學以及診斷學等領域(Bustin,2002,Bustinetal.,2005;Nolanetal.,2006)。也正是這些優(yōu)點使得它對RNA的質量和完整性以及模板cDNA的質量和數量、引物的特異性、擴增效率、內參基因的選擇等要求嚴格(Bustin,2000;VanGuilderetal.,2008)。選擇不合理的內參基因將會給實驗結果帶來很大誤差。一個理想的內參基因應該在任何實驗環(huán)境和條件下均能穩(wěn)定表達。內參基因是細胞的基本轉錄組成分,參與維持細胞的基本功能,且與要分析的目標基因有相似的表達水平(Thellinetal.,1999;SchmittgenandZakrajsek,2000;Suzukietal.,2000;Warringtonetal.,2000;Dhedaetal.,2004;Udvardietal.,2008;袁偉等,2012)。目前,常用的看家基因有很多,包括甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate,GAP-DH)、肌動蛋白(actin)、泛素(ubiquitin,UBQ)、泛素結合酶(ubiquitinconjugatingenzyme,UBC)、18S核糖體RNA(18SrRNA)、25S核糖體RNA(25SrRNA)、轉錄延伸因子(elongationfactor1alpha,EF1α)、微管蛋白(tubulinbeta,TUB)和翻譯延長因子(translationelongationfactor,TEF)等的編碼基因(Bustin,2002;Kimetal.,2003)。不過,許多看家基因的轉錄水平會隨植物發(fā)育階段和實驗條件的不同而有所不同(Thellinetal.,1999;Dhedaetal.,2004)。至今還沒有發(fā)現一個適合作為所有條件下基因表達分析的內參基因的看家基因(Thellinetal.,1999;SchmittgenandZakrajsek,2000;Suzukietal.,2000;Warringtonetal.,2000)。例如,MehdiKhanlou和VanBockstaele(2012)研究發(fā)現,紅三葉(Trifoliumpratense)的UBC2和UBQ10是葉中表達最穩(wěn)定的2個看家基因,UBC2和YLS8在莖中表達比較穩(wěn)定,EIF-4a和UBC2在根中表達穩(wěn)定,而GAPDH和SAND在各個組織中的穩(wěn)定性均較低。此外,ACT、ubiquitin、18SrRNA、EF1α、TUB和TUA等已應用于楊樹基因表達的分析中,但在系統(tǒng)篩選方面尚有欠缺(RegierandFrey,2010;Xuetal.,2011;Pettengilletal.,2012)。為了增加qRT-PCR數據的準確性,系統(tǒng)分析這些常用看家基因的穩(wěn)定性非常重要。為此,本研究系統(tǒng)分析了7個看家基因(TUA8、TUB6、ubiquitin、GAPDH、actin、18SrRNA和EF1α)在8個毛果楊組織以及鋅脅迫下的組培苗根、莖、葉中的表達。其中,actin、ubiquitin和EF1α曾被用于分析干旱脅迫條件下楊樹基因的表達(Pettengilletal.,2012)。獲得的數據經geNorm(Vandesompeleetal.,2002)、NormFinder(Andersenetal.,2004)和BestKeeper(Pfaffletal.,2004)3個統(tǒng)計學軟件評估決定各看家基因的穩(wěn)定性。通過用上述看家基因比較分析毛果楊NAC基因的表達數據,結合驗證軟件的評估結果所得的穩(wěn)定性,最終發(fā)現actin、ubiquitin、EF1α和18SrRNA的穩(wěn)定性較好,可用作毛果楊基因表達研究的內參基因。1材料和方法1.1patorrr.&gra材料本實驗所用毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.&Gray)不同組織的材料取自中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所人工氣候室一年生毛果楊;鋅脅迫下不同組織的材料取自溫室生長2個月且長勢一致的毛果楊組培苗。1.2試劑和機器1.2.1ptiiirex4xfixRNA提取試劑采用百泰克公司的裂解液PL。反轉錄試劑盒SuperScriptIIIReverseTranscriptase購自美國Invitrogen公司。DNA消化酶、DNAMarker及實時定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司北京分公司合成。1.2.2儀器熒光定量儀器為CFX-96實時熒光定量PCR儀(BIO-RAD)。1.3方法1.3.1總rna的提取從一年生毛果楊植株上由上向下取第2、3(Le2-3)和第5(Le5)個葉片、第2–3節(jié)間(St2-3)及第4–6節(jié)間正分化的木質部(Xy4-6)和韌皮部(Ph4-6)組織、第12–25節(jié)間正分化的木質部(Xy12-25)和韌皮部(Ph12-25)組織以及幼根(Rt),迅速置于液氮中保存。參照RNA裂解液試劑盒提取使用說明提取總RNA。獲得的總RNA用DNA酶處理,去除基因組DNA污染。之后,用Nanodrop核酸分析儀測定總RNA的濃度和純度。再用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。取生長2個月且長勢一致的毛果楊組培苗頂芽(1–2cm),分別在含有0、1、40μmol·L–1ZnSO4的WPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天。收集根、莖、葉,置于液氮中保存。RNA提取的具體步驟參照崔秀娜等(2012)所述方法。1.3.2調配tt反應cDNA鏈的合成按照SuperScriptIII(Invitrogen)試劑盒說明書要求進行。配制20μL的反應體系:總RNA1.5μg,1μL隨機引物(100μmol·L–1),1μLdNTPmix(10mmol·L–1),加DEPC水補足至20μL。65°C加熱5分鐘后,迅速放在冰上2分鐘,然后于4000×g離心10秒。加入4μL5×FirststandBuffer,1μLDTT(100mmol·L–1),1μLRRI,1μLSuperscriptIII,再于4000×g離心15秒。最后,50°C反應45分鐘。終止反應采用70°C加熱15分鐘。稀釋40倍后放入–20°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3.3閱讀人類疾病的選擇和索引設計1.3.4pcr檢測采用大連寶生物工程有限公司的SYBRRPremixExTaqTMII實時定量PCR試劑盒進行定量分析。使用Bio-RadiCyclerIQ實時定量PCR儀和96孔板。每個孔按照20μL體系加樣:4μL模板cDNA,0.8μLForward引物(10μmol·L–1),0.8μLReverse引物(10μmol·L–1),10μLSYBRRPremixExTaqTMII,4.4μL無菌水。每個樣品重復3次。擴增反應程序為:95°C預變性30秒;95°C變性5秒,60°C退火18秒,72°C延伸15秒,39個循環(huán)。采集溶解曲線熒光信號。實驗數據采用相對定量法分析。1.3.5標準曲線的繪制等量取8個樣品的cDNA模板,混合后依次稀釋6個梯度,每個梯度稀釋5倍,則濃度分別為1、1/5、1/25、1/625、1/3125和1/15625倍。每個反應設4個重復。溶解溫度通過PCR儀自帶的計算軟件CFXManagerTMSoftware得到。根據所得CT值繪制標準曲線,得到斜率k和線性相關系數R2。根據公式E=5–1/K–1,計算得出擴增效率E。1.3.6內部基因參考參數的特異性測定將qRT-PCR反應產物進行瓊脂糖(2%)凝膠電泳,分析擴增長度、電泳條帶數及是否有非特異性擴增等。1.3.7不同表達穩(wěn)定性指數使用geNorm、Normfider和BestKeeper3個軟件分析看家基因在毛果楊8個組織以及鋅脅迫下的組培苗根、莖、葉中的表達穩(wěn)定性指數。其中geNorm和Normfider程序需要將CT值轉化成Q值后,方可進行分析。轉化公式為Q=Ectmin–ctsample(E為基因的擴增效率。當擴增效率接近100%時,E通常默認為2。ctsample為該基因在各個組織中的CT值,ctmin為該基因在所有組織中最小的CT值)。BestKeeper軟件可以直接對各看家基因的CT值進行分析。2結果與討論2.1毛果楊葉片rna的表達用裂解液提取毛果楊8個組織的總RNA,DNA酶消化處理后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現電泳條帶清晰,沒有彌散現象,且28SrRNA帶比18SrRNA帶亮,說明RNA的完整性良好,沒有降解(圖1)。再用Nanodrop檢測RNA的濃度和純度,結果表明A260/280和A260/230均在2.0–2.1之間,說明RNA的純度較高,符合后續(xù)實驗的要求。用Trizol試劑提取鋅脅迫下的毛果楊組培苗的根、莖、葉總RNA,經檢測完整性較好。具體操作方法參見崔秀娜等(2012)所述。2.2pcr擴增效率檢測根據已知的看家基因序列,設計TM值在78.5–86°C之間的特異性引物。以5倍濃度梯度稀釋的cDNA為模板,進行qRT-PCR擴增,根據獲得的數據作7個看家基因的標準曲線。結果顯示各看家基因的決定系數R2≥0.990,引物的擴增效率在95.0%–105.0%之間,均符合qRT-PCR對擴增效率的要求(表1)。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果表明所得目的條帶大小與理論值一致,且沒有發(fā)現其它條帶,不存在非特異性擴增(圖2)。進一步分析溶解曲線,發(fā)現各看家基因都只產生單一的溶解峰,各重復樣品間的曲線重復性好,未加模板的對照組無對應信號(圖3)。上述結果說明所設計引物的特異性良好,qRT-PCR反應的專一性高,結果準確可靠。2.3家基因ct值CT值與基因的表達量成反比,即CT值越大,表達量越小,反之亦然。qRT-PCR的結果表明,7個看家基因的CT值在10–33之間,其中18SrRNA的CT值最低,在10–14之間;TUA8和TUB6的CT值較高,在25–33之間;actin、ubiquitin和EF1α的CT值則在21–29之間(圖4),說明各看家基因的表達量不同,有的差別較大。2.4統(tǒng)計學分析我們用BestKeeper、geNorm和NormFinder3個軟件對7個看家基因的穩(wěn)定性進行統(tǒng)計學分析。這3個軟件均基于qRT-PCR后得到的CT值進行分析。其中best-Keeper程序可以直接對CT值進行分析;而geNorm和NormFinder軟件則需要將CT值轉換成相對表達量再進行分析。2.4.1相對穩(wěn)定的測定geNormV3.5軟件根據平均表達穩(wěn)定指數M值確定最穩(wěn)定的看家基因。M值越大,基因的穩(wěn)定性越低,反之則越高。以M=1.5為上限,只有小于1.5的才被認為相對較為穩(wěn)定。geNorm分析結果表明,7個看家基因的M值均小于1.5,說明7個看家基因都較為穩(wěn)定。在7個看家基因中,actin和ubiquitin的M值最低,說明它們的穩(wěn)定性較好;TUB6的M值最高,穩(wěn)定性也是所選看家基因中最差的;其余4個看家基因的M值則介于它們之間。7個看家基因的穩(wěn)定性從高到低依次為:actin=ubiquitin>18SrRNA>EF1α>GAPDH>TUA8>TUB6(圖5)。2.4.2基因穩(wěn)定性測定BestKeeper程序依據看家基因的CT值用EXCEL軟件計算標準偏差SD。SD值越小,基因的穩(wěn)定性越好。若SD>1,則認為該基因不穩(wěn)定。分析結果(表2)顯示,TUA8、TUB6和GAPDH的SD值大于1,其余都小于1。按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為EF1α>ubiquitin>18SrRNA>actin>GAPDH>TUA8>TUB6。2.4.3不同菌株的m值比較NormFinder程序用EXCEL軟件計算基因的穩(wěn)定值M。M值越低,則該基因越穩(wěn)定。經計算獲得7個看家基因的M值。如表3所示,actin的M值最低,說明它是所選看家基因中穩(wěn)定性最好的;TUB6的M值最高,說明它的穩(wěn)定性最差。7個看家基因按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為:actin>18SrRNA>ubiquitin>TUA8>GAPDH>EF1α>TUB6。2.5個小組的穩(wěn)定性分析使用BestKeeper、geNorm和NormFinder3個軟件對鋅脅迫下毛果楊組培苗根、莖、葉中7個看家基因的穩(wěn)定性進行統(tǒng)計學分析(表4)。geNorm軟件分析結果顯示,EF1α和18SrRNA的M值最低,說明它們的穩(wěn)定性較好;GAPDH的M值最高,穩(wěn)定性較差;7個看家基因按照穩(wěn)定性從高到低排序依次為:EF1α=18SrRNA>ubiquitin>actin>TUA8>TUB6>GAPDH。BestKeeper軟件分析結果顯示,ubiquitin的SD值最低,穩(wěn)定性較好;GAPDH的SD值大于1,穩(wěn)定性最差;7個看家基因的穩(wěn)定性排序為ubiquitin>18SrRNA>actin>EF1α>TUA8>TUB6>GAPDH。NormFinder軟件分析結果顯示,EF1α的M值最低,說明其穩(wěn)定性較好;穩(wěn)定性排序為EF1α>actin>18SrRNA>TUA8>ubiquitin>TUB6>GAPDH。綜合3個軟件的分析結果表明,ubiquitin、EF1α、18SrRNA和actin的穩(wěn)定性較好,GAPDH的穩(wěn)定性最差。2.6基因表達差異為了驗證上述結果,研究不同的看家基因作為qRT-PCR分析基因表達時的內參基因對實驗結果的影響,我們采用qRT-PCR法分析了4個受微小RNA(miR-164)調控且功能未知的毛果楊NAC轉錄因子家族基因的表達(Luetal.,2008)。分別以7個看家基因為內參基因分析4個NAC家族基因的相對表達量,發(fā)現以actin、ubiquitin、EF1α和18SrRNA為內參基因時在各組織中的表達趨勢基本一致;而以GAPDH、TUA8和TUB6為內參基因時的表達趨勢則與前幾個明顯不同。其中PNAC041在第5個葉片(Le5),PNAC042在第2、3(Le2-3)和第5(Le5)個葉片以及嫩莖(St2-3)中的表達顯著不同,在其它組織部位的趨勢基本一致。PNAC154和PNAC155在第5(Le5)個葉片中的表達量不同(圖6)。上述結果說明,在用qRT-PCR分析基因表達時選擇不恰當的內參基因將可能導致錯誤估計目標基因的相對表達量,由此可見內參基因選擇的重要性。此外,我們發(fā)現所分析的PNAC041和PNAC154基因在根中的表達量很高,在其它部位基本不表達,說明它們特異地調控根的發(fā)育。PNAC042在第4–6節(jié)間正分化的木質部(Xy4-6)表達量很高,在第2、3(Le2-3)和第5(Le5)個葉片及嫩莖次之,其它部位較低;PNAC-155在根中最高,在第4–6節(jié)間(Ph4-6)及第12–25節(jié)間(Ph12-25)正分化韌皮部組織的表達量次之,其它部位較低。這些結果與Hu等(2010)的研究結果基本一致,將為進一步研究該家族基因的功能奠定基礎。2.7rt-pcr檢測相關基因的表達近年來,qRT-PCR技術憑借其特異性強、靈敏度高、重復性好和快速高效等優(yōu)點被廣泛用于基因表達的研究(Udvardietal.,2008)。應用qRT-PCR技術分析基因表達時,內參基因的選擇很重要。如果選用不恰當的內參基因,有可能得出錯誤的結論。因此,正式分析目標基因的表達之前,很有必要對看家基因進行篩選。本研究系統(tǒng)分析了α微管蛋白(TUA8)、β微管蛋白(TUB6)、泛素(ubiquitin)、甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)、肌動蛋白(actin)、18S核糖體RNA(18SrRNA)和轉錄延伸因子(EF1α)7個看家基因在8個毛果楊組織中以及鋅處理的毛果楊組培苗根、莖、葉中的表達。經geNorm、NormFinder和BestKeeper3個常用于分析看家基因穩(wěn)定性的軟件評估(Vandesom-peleetal.,2002;Andersenetal.,2004;Pfaffletal.,2004),結果表明這些內參基因的排序略有不同,這種不一致性可能是由于計算機軟件的統(tǒng)計學算法不同造成的(Huetal.,2010)。這種現象在柑橘(Citrusreticulata)以及其它植物看家基因的研究中也曾出現(Hongetal.,2008;Wanetal.,2010;Huisetal.,2010;Mafraetal.,2012)。綜合來看,actin、ubiquitin和EF1α的穩(wěn)定性較好。actin是細胞骨架的主要成分,幾乎在所有真核細胞中均有表達,是RT-PCR內參基因的最佳選擇(SantellaandChun,2011)。Ubiquitin是廣泛存在于真核細胞中的熱穩(wěn)定多肽,進化上高度保守,在介導蛋白質降解、轉錄調節(jié)和應激反應中發(fā)揮重要作用(Hochstrasser,2000)。EF1α是一種重要的多功能蛋白,參與許多重要的細胞學過程,包括信號轉導、翻譯控制、凋亡、細胞骨架組成、病毒復制及癌基因轉化等(Zhouetal.,2007)。在干旱脅迫下的楊樹組織中,這3個基因的表達也很穩(wěn)定(Pettengilletal.,2012)。此外,ACT7、EF1α和UBQ在梧桐(Firmianasimplex)種子不同發(fā)育階段中的表達比較穩(wěn)定(Hanetal.,2012);β-actin在茶樹(Camelliasinensis)不同器官組織中的表達較穩(wěn)定(孫美蓮等,2010);actin和ubiquitin是丹參(Salviamiltiorrhiza)中穩(wěn)定性最好的2個看家基因(Yangetal.,2010);ACT11和EF1α在荷花(Nelumbonucifera)中表達較為穩(wěn)定(Luoetal.,2010);ACT7是油菜(Brassicacampestris)胚胎中最穩(wěn)定的看家基因(Chenetal.,2010);在菊苣(Cichoriumendivia)和番茄(Lycopersiconesculentum)葉子及根組織中ACT最為穩(wěn)定(L?vdalandLillo,2009;Maroufietal.,2010;Xuetal.,2011);在黑麥草(Loliumperenne)和葡萄(Vitisvinifera)漿果的不同發(fā)育階段、黃瓜(Cucumissativus)和楊樹的多個組織中EF1α最穩(wěn)定(Reidetal.,2006;Martin,200