高效液相色譜普法

測定牛奶中雌激素的含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）了解高效液相色譜儀的組成及各部分的功能。（2）掌握利用液相色譜進(jìn)行分析的一般實(shí)驗(yàn)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：

為了檢測市面上出售的奶粉中是否含有雌激素，我們需要在進(jìn)行前處理后，將溶液進(jìn)行色譜分析以求得奶粉中含有的四種雌激素的含量。由于奶粉中含有大量的蛋白質(zhì)和核苷酸，在前處理中我們必須除去這些物質(zhì)，所以我們選擇在加入正己烷除去油脂后，萃取雌激素（此時(shí)已經(jīng)除去了一大部分不溶于乙腈溶液的物質(zhì)），再通過吹干過濾，我們就獲得了符合色譜分析要求的待測液。由于雌激素在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)不同，在選擇了合適的分析條件后就可以將它們分離，再通過色譜儀所得到的數(shù)據(jù)我們就可以知道各類雌激素確切的含量。

三、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑：儀器：高效液相色譜儀、氮吹儀、離心機(jī)、超聲波振蕩器、0.45um微孔濾膜、50ml塑料管、離心管、分析天平。試劑：奶粉、標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、正己烷、乙酸鈉。四、實(shí)驗(yàn)步驟：樣品前處理：取三支塑料管，編號(hào)為A,B,C。用分析天平分別稱約1g奶粉，加入A,B,C三管，記錄三管內(nèi)的奶粉質(zhì)量。把A管奶粉交給學(xué)長，學(xué)長向A管中加入2.00ml未知濃度的標(biāo)液。使用1.00ml移液槍，分別向B,C塑料管中加入4.00ml標(biāo)液.

以A組為例，B,C組照A組進(jìn)行。向這A組塑料管中加入約2ml正己烷，震蕩，靜置，完全分層后，移除上清液,再重復(fù)三次。這是為了除去上清液中含有的油脂成分。

向A組塑料管中用1.00ml移液槍移入10.00ml乙腈溶液，震蕩，置于超聲波振蕩器中超聲震蕩30分鐘，使之混合均勻，取出。馬上將之分配到三個(gè)塑料離心管中。用一般的電子秤稱重，并使用乙腈溶液調(diào)節(jié)三個(gè)塑料離心管重量，使之均相同，再用蒸餾水配出一支與上述離心管單支等重的塑料離心管。將所得的四支塑料離心管兩兩對(duì)稱的放入離心機(jī)中，以4000r/min的速度離心10min，取出，將含奶粉的三支塑料離心管中的上清液小心倒入標(biāo)號(hào)為A1的大塑料管中。

將倒出上清液的三支塑料離心管重量用乙腈溶液調(diào)回原值，按上述步驟離心，并取得上清液，重復(fù)此步驟兩次，即分三次用乙腈溶液萃取雌激素。此時(shí)我們得到A1,B1,C1三支裝著萃取液的大塑料管。四、實(shí)驗(yàn)步驟：

使用氮吹儀在45℃下吹干溶液。

再將這三支試管分別用1.00ml移液槍移入1.00ml乙腈溶液定容，充分震蕩。置于超聲波清洗儀中超聲震蕩30分鐘。分別用0.45um過濾模過濾到對(duì)應(yīng)編號(hào)的干燥的a，b，c下小塑料管中。2.進(jìn)樣

開啟色譜儀，打開相應(yīng)軟件，輸入掃描波長為280nm，讓恒溫箱溫度恒定為30攝氏度，點(diǎn)擊運(yùn)行，等待20min觀察視窗內(nèi)直線是否平穩(wěn)，若不平穩(wěn)則繼續(xù)點(diǎn)擊開始，直到得到一條平穩(wěn)的直線為止，這一步是為了用流動(dòng)相沖洗好柱子。用乙腈溶液清洗進(jìn)樣針至少十次，進(jìn)樣口至少5次。使用待測液（a管內(nèi)溶液）潤洗進(jìn)樣針3次，再用進(jìn)樣針取大約40ul待測液，排除氣泡后，進(jìn)樣針中剩余20ul待測液。向進(jìn)樣口進(jìn)樣，馬上扳下六通閥，等待2min，扳上六通閥，等待20min，保存圖譜，再打開軟件進(jìn)行峰面積標(biāo)注，保存。以相同操作獲得b，c管的數(shù)據(jù)。五、數(shù)據(jù)處理：三次分別稱取奶粉的質(zhì)量為：M1=1.0693g；M2=1.0346g；M3=1.0348g；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖可以分別對(duì)E1、E2、E3、DES進(jìn)行定性。根據(jù)A譜圖可以讀出E1、E2、E3、DES對(duì)應(yīng)的峰面積分別為：7.2288、76221、86