植物組織石蠟切片的制作一、試驗目的1．嫻熟把握石蠟切片的方法。把握永久制片的制作過程，為爭論植物的內(nèi)部構造奠定根底。學會植物內(nèi)部構造的比較爭論方法。二、試驗器具與試劑器具石蠟切片機、烘箱、顯微鏡、染色缸、小培育皿、鑷子、毛筆、吸水紙、紗布、載玻片、蓋玻片等。試劑10%番紅水溶液、0.5%固綠〔用95%的酒精配制〕、酒精〔100%、95%、80%、70%、50%〕、二甲苯、蒸餾水、甘油、中性樹膠等。三、試驗材料幼嫩植物各局部，依據(jù)季節(jié)選擇材料。四、試驗內(nèi)容與方法切片機切片，可以切出很薄的切片。但凡精細的工構造，大都用石蠟切片。全都過程如下：1．固定2．洗滌34．脫酒精2．封埋6．切片7．粘片8．脫蠟9．染色10．脫水11.透亮12．膠封〔一〕固定1．固定的意義：固定就是用藥品把細胞殺死，使細胞的原生質凝固，死后不發(fā)生變化，盡質全部凝固；不發(fā)生任何變形，增加折光率，并且不阻礙染色。2．固定液的種類：固定液的種類很多，依據(jù)配制成分可劃分為：簡潔固定液：以一種化學藥品配制的固定液。常用的簡潔固定液有：A．酒精即乙醇，用作固定液，常用純酒精或95％酒精。酒精穿透力強，固定時間常在1小時70酒精即95％的酒精，絕不行用純酒精。酒精為復原劑，不能與鉻酸、鋨酸、重鉻酸鉀等氧化劑協(xié)作。酒精可使核酸，蛋白質及肝醣等發(fā)生沉淀，但能溶解脂肪及擬脂。B．福爾馬林即甲醛，具猛烈刺激性的氣味，純潔的甲醛，為無色透亮液體。固定用的濃度為4-10％甲醛也是強復原劑。不能與鉻酸、鋨酸等氧化劑協(xié)作。經(jīng)固定后，材料變硬，通常不其他液體混合使用。C．醋酸：為無色透亮的液體，刺激性極強，冷則分散成冰，故又叫冰醋酸。醋酸以與水和酒精配成各種比例的溶液，所用濃度為0.2～5％，也常與其他固定劑協(xié)作使用。醋酸穿透性很強，單獨使用，有使原生質膨脹的作用，故常與酒精，甲醛等合用，醋酸為固定染色體的優(yōu)良固定液，因此固定染色體的固定液中，幾乎都含有醋酸?；旌瞎潭ㄒ海河蓭追N藥劑，適量配制而成。常用的有以下幾種：A、F.A.A限制，短為24小時，長可延至數(shù)月或數(shù)年。野外工作，格外便利。并且固定的材料，不阻礙染色，但對染色體的固定不佳。材料固定后，用50％酒精洗滌數(shù)次。[配法]5070％酒精90冰醋酸5福爾馬林55070％酒精配制。B、卡爾諾氏(Carnoy”s)固定液40-6095％酒精沖洗，在組織不能馬上處理時，需轉入70％酒精中保存。配法有兩種：C．納瓦興(Navaschjn”s)固定液方已很少應用，現(xiàn)所用的都是改進液，且種類很多，如材料較柔嫩，含水量較多，可用配方I、Ⅱ；材料較堅硬，含水量較少，可用Ⅳ、V配方，其中配方Ⅱ對植物胚胎學制片特別適用。為了使用便利，常分別配成甲、乙兩種基液，用時臨時等量協(xié)作。固定時間為12-24小70％酒精洗滌數(shù)次。(二)洗滌材料固定后，藥劑連續(xù)留在組織中，易使組織破壞，必需用水或酒精洗去。用什么去洗，可依據(jù)三條原則：1．凡用水溶液配制的固定液，特別是含有鉻酸、重鉻酸鉀的固定液，一律用水洗。凡用酒精配制的固定液，一律用同濃度的酒清洗。如固定液中含有苦味酸．在70％在洗滌時，須加碘液，可除去汞的結晶?！踩趁撍c硬化材料洗滌后，其中含水，水與石蠟不能混合，必需洗去。去水用酒精，材料由水入酒精中，不能操之過急，須由低度酒精漸至高度酒精。通常由30％、50％、70％、80％、90％，每次須經(jīng)半小時，材料大的，時間須延長。假設臨時不能埋蠟、材料可放在70％酒精中保存，經(jīng)久不壞。在高度酒精中，不能過久．因酒精能使材料硬化，過久則材料由硬而脆，切時易于粉碎?！菜摹趁摼凭牧厦撍螅牧现腥凭?，酒精與蠟也不能混合，仍須除去。脫酒精通常用二甲苯，材苯須換一、二次才行。時間每次約半小時。二甲苯不僅脫去酒精，并且透亮，所以又叫透亮劑?！参濉陈裣灴渴炛С?，才能切成薄片。另一方面，材料封埋后，不僅材料外面包著蠟，材料內(nèi)面全部其他變形。所用石蠟，質地必需純潔，溶點通常在48～56℃這個范圍內(nèi)，以52℃的石蠟用得更多。在材料不硬，天氣不熱時，宜用較低熔點的蠟。材料硬，天氣熱的情形下，宜用高溶點的蠟。石蠟選定后，將石蠟切成小塊，置瓷皿中加熱溶蠟，待石蠟近于全部熔化時，置于溫箱中。在進展封埋的全部過程中，石蠟的溫度，總以高于溶點2℃為宜，過低石蠟凝固，過高損害材料?；旌弦航灒儆眉兪灀Q一、二次，每次的時間，視材料大小而定，通常每次半小時，材料大，時間必需加長。在浸蠟的過程中，須留意溫度，不能超過2℃以上。浸蠟后，須將材等，然后把蠟倒入盒內(nèi)，將材料移入紙盒中，依將所要切的方向，妥當排列，再以兩手平持紙盒，移至冷水中，用口在蠟面上吹氣，促其分散，待蠟面凝成簿層時，將紙盒全部沉入。水冷凝后，將紙撕去，即獲蠟塊，至此埋蠟完成。折紙盒按以下挨次折疊：AABB”；CCDD”；CEAE”、向外夾出EE”。同樣折出FF”，GGHH”；CE”E與E”IE兩三角形相疊，并沿E”CEI角；折RIJF向外，同樣折出GKLH，即折成所需的紙盒?！擦城衅炃衅眯D切片機。一個旋轉切片機，可分三個局部，一個是安裝切片刀的局部，有調(diào)整刀片斜度和固著刀片的螺旋。一個是安裝材料的局部，也有螺旋可以調(diào)整材料的位置。另一個是操縱在旋轉中向前推動的局部，掌握著切片的厚薄，是比較重要而簡單的局部。切片步驟：先將冷凝的蠟塊，切成小塊，粘固在小木頭上。安裝切片刀，刀的斜度，格外重要，最好先切除的蠟塊試刀，以確定刀的斜度，一經(jīng)調(diào)度適合后，就不要任憑變動，以免每次試刀的麻煩。3．修整蠟塊，刀片斜度調(diào)好后，將刀片移近蠟塊，使小蠟塊的下邊與刀鋒平行，然后把它固定，再轉下蠟塊．呈矩形才行。只有平坦的蠟塊，才能切出平坦的蠟帶。4．最終依據(jù)需要，調(diào)整掌握切片厚度的機制。調(diào)度后，把它固定下來。上述四步驟完成后，就可進展切片，將切出的蠟帶，平展于盒內(nèi)以供粘片?！财摺痴称牧锨谐杀∑螅殞⑶衅吃诓Ａ?，加熱開放，這叫粘片上，使切片開放燙平，材料不現(xiàn)皺紋為度。最終將切片依次排好，用濾紙吸去多余水分，同時以記號筆在玻片上編號，放入溫箱中烘干，溫度30～40℃約1小時即干。常用的膠液有以下三種：明膠液：這是粘片最常用的膠液，簡便優(yōu)良，配法是1004毫克，加熱熔化，過濾即得。梅氏蛋白質：雞蛋清50ml甘油50m1水楊酸納1g15滴，放入純水50毫升中即得。Land阿拉伯膠1重鉻酸鉀0.2純水100〔八〕脫蠟玻片烘干后，須將蠟脫去，才能染色，脫蠟用二甲苯，再經(jīng)酒精入水中，而后染色，其挨次如下：二甲苯→1/2二甲苯十1/2→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→水→染色5～10〔九〕染色方法介紹如下：番紅與固綠色法番紅用l％的水溶液，固綠用0.5％的酒(用95％的酒精配制)，染色步驟如下：爭論和留意點：用番紅和固綠這個組合染成的切片，木化、栓化和角質的細胞壁，被番紅染成鮮紅色，纖維素的細胞璧，被固綠成綠色。就維管束來講，木質部染紅，韌皮部染綠，區(qū)分極清楚。在50％酒精中脫色，需經(jīng)實踐，如脫色不夠，綠色難得染好，脫色太過分，做出來的切片，紅色太淡，甚至于全是綠色，失掉了二色染法的用意。染色時間，不是確定的，常因材料種類，切片的厚簿而不同，在沒有把握時，最好選用少數(shù)材料試染，試染成功后，再依次大批染色。海氏鐵礬—蘇木精染色法：又用鐵明礬液鑒定(脫色或分色)。所用鐵明礬液，為2～4％的水溶液，此液須在用前數(shù)日臨時配制。配成后不能見光，須置暗處，或用有色玻瓶裝。也不能保存太久，大約二月內(nèi)可用，用時，每次更換。0.51～2用，故必需先配制。蘇木精在水中溶解很慢，約需10日才能完全溶解，假設需用不急，可直接用蒸餾水配制。假設想加速溶解，可先用酒精溶解，再參加蒸餾水。蘇木精0.5酒精10蒸餾水90染色步驟如下：此染色法在細胞學及胚胎學制片上應用很廣，是顯示細胞一般構造及細胞分裂的優(yōu)良染色留意的是：①分色后，用水洗凈鐵礬液，最好用流水，如無流水，須多更換水。假設沖洗不凈，將來連續(xù)褪色。②在鐵礬液中分色，須時常取出在顯微鏡下檢查，到細胞質的染色很淡即止?！彩趁撍⑼噶?、膠封用樹膠封片，其步驟與前面所述永久制片一樣。處理；制片必需薄而透亮，才能在顯微鏡下成像，除將材料切成薄片或通過輕壓或其他手段使之分散外，還需承受其他方法使它透亮和染色，以便更好地觀看到構造的細節(jié)。需長期保存的制