植物同源bhlh轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及生物信息學分析

多細胞生物的正常生長依賴于維持細胞的適當排列和分裂。如果破壞這一平衡，就會導致器官的生長和發(fā)育異常。bHLH(basichelix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子是真核生物的生長發(fā)育過程中的一類重要轉(zhuǎn)錄因子,構(gòu)成了真核生物蛋白質(zhì)中的一個大家族,其成員在生物的生長發(fā)育過程中起著極為重要的調(diào)控作用。植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育、脅迫應答和植物次生代謝中起到重要作用。例如,bHLH可以參與植物的生長發(fā)育和形態(tài)建成,轉(zhuǎn)錄調(diào)控復合體(MYB-bHLH-WD40)可以調(diào)控表皮毛和根毛的發(fā)育;bHLH轉(zhuǎn)錄因子還參與了脅迫應答作用,Kiribuchi等報道外源JA誘導水稻bHLH轉(zhuǎn)錄因子RERJ1基因在營養(yǎng)生長期的葉片、葉鞘和根中表達,并且RERJ1基因在傷害和干旱脅迫下的葉片中上調(diào)表達;bHLH轉(zhuǎn)錄因子對植物次生物質(zhì)代謝和花色素生物合成等方面也起著重要的調(diào)節(jié)作用,研究表明,含有bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子R基因的產(chǎn)物Lc參與調(diào)控植物多個組織花青素的合成,對花青素合成的時間、分布和數(shù)量具有決定性作用。楊樹在全世界廣為栽植,也是我國主要用材樹種之一。小黑楊(Populus×xiaoheiT.S.HwangetLiang)在我國大部分地區(qū)均有種植,具有生長快、適應能力強的特點,有著較強的抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿等生物學特性。其材質(zhì)細密,色白,心材不明顯,是良好的造紙用材,并在民用木材方面有著重要作用。小黑楊在黑龍江等干旱、寒冷地區(qū)長勢較好,是我國北方荒沙、干旱地區(qū)優(yōu)良的速生綠化樹種。本研究中獲得的2個bHLH轉(zhuǎn)錄因子PxbHLH01和PxbHLH02與擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子bHLHUPBEAT1(UPB1)具有較高的同源性,而后者在擬南芥的活性氧代謝以及調(diào)節(jié)植物根部細胞增殖與分化過程中起到了重要作用,UPB1通過直接調(diào)控一組氧化物酶來調(diào)控細胞增殖和分化之間的平衡。筆者認為PxbHLH01和PxbHLH02也可能在這些方面具有重要的調(diào)控作用。為給小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02基因功能的研究提供參考,對小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02轉(zhuǎn)錄因子基因的編碼區(qū)和啟動子區(qū)進行了克隆,同時進行了詳細的生物信息學分析。1材料和方法1.1試驗材料制備小黑楊(Populus×xiaoheiT.S.HwangetLiang)取材于東北林業(yè)大學實驗林場,取小黑楊新鮮葉片,液氮凍存后使用。1.1.2pcd擴增PrimerstarTaq酶、凝膠回收試劑盒、T4DNA連接酶、JM109感受態(tài)細胞、pMD18-T載體,購自于寶生物工程(大連)有限公司,擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2方法1.2.1pcr擴增h010以小黑楊新鮮葉片作為材料,應用CTAB法提取總RNA。應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照毛果楊基因組序列,對PxbHLH01和PxbHLH02基因分別設計特異引物(見表1),以小黑楊葉片cDNA為模板,進行PCR擴增。PCR擴增程序:94℃預變性3min;94℃變性45s;55℃退火45s;72℃延伸90s;共30個循環(huán);72℃延伸10min。應用凝膠回收試劑盒對特異性擴增產(chǎn)物回收純化,純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化克隆進入JM109感受態(tài)細胞,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。1.2.2pcr擴增h2c以小黑楊新鮮葉片作為材料,應用CTAB法提取總DNA。參照毛果楊基因組序列,對PxbHLH01和PxbHLH02基因上游啟動子區(qū),按照擴增片段為800~2000bp大小,分別設計特異引物(見表2),以小黑楊葉片的DNA為模板,進行PCR擴增。PCR擴增程序:94℃預變性3min;94℃變性45s;55℃退火45s;72℃延伸150s;共30個循環(huán);72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物直接送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。1.2.3phxbhlh00信號肽和gocr基因序列分析利用在線分析工具GENSCAN對小黑楊PxbHLH01和PxbHLH02基因的核苷酸序列進行分析。利用在線分析軟件Protparam對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的理化性質(zhì)進行分析。利用在線分析軟件ProtScale的KyteandDoolittle算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行親水/疏水性分析。利用在線分析工具SignalP的神經(jīng)網(wǎng)絡算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行信號肽的預測和分析。利用在線工具TMPred進行跨膜結(jié)構(gòu)預測和分析。利用在線分析工具COILS進行卷曲螺旋預測和分析。利用在線工具wolfpsort進行亞細胞定位分析。采用GOR4分析蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast對PxbHLH01和PxbHLH02基因序列以及推測的編碼蛋白進行同源序列比對,搜索不同物種中的同源基因及蛋白。根據(jù)李軍等推薦的軟件組合,先采用ClustalX將氨基酸序列進行多序列比對的分析,然后利用MEGA5.0軟件,算法為NeighborJoining,自檢舉1000次,構(gòu)建進化樹。。2結(jié)果與分析2.1pcr擴增結(jié)果以小黑楊葉片cDNA為模板進行PCR擴增,擴增結(jié)果如圖1所示。連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化克隆進入JM109感受態(tài)細胞后,通過與NCBI比對,確定獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因序列,分別為411bp和417bp。經(jīng)過比對,與擬南芥UPBEAT1、bHLH151基因核苷酸序列(AT2G47270.1)的一致性分別為38.85%和40.71%;與毛果楊未知功能基因核苷酸序列(XM_002320932.1)的一致性分別為97.57%和82.73%;與毛果楊未知功能基因核苷酸序列(XM_002301486.1)的一致性分別為82.38%和98.32%。以小黑楊葉片DNA為模板進行PCR擴增,擴增結(jié)果如圖2所示。對PCR擴增產(chǎn)物直接測序,通過與NCBI比對,確定獲得了PxbHLH01和PxbHLH02基因啟動子序列,長度分別為1360bp和1913bp。經(jīng)過比對,與毛果楊未知功能基因(XM_002320932.1)啟動子的一致性分別為95.17%和68.91%;與毛果楊未知功能基因(XM_002301486.1)啟動子的一致性分別為69.46%和96.25%。2.2pxb骨架01和pxb骨架02的質(zhì)量分析2.2.1u3000結(jié)構(gòu)蛋白等電點及不穩(wěn)定系數(shù)利用在線分析軟件Protparam對PxbHLH01和PxbHLH02基因的氨基酸序列的理化性質(zhì)進行分析。PxbHLH01蛋白等電點(pI)為10.39;不穩(wěn)定系數(shù)為38.22(不穩(wěn)定系數(shù)小于40時,預測蛋白質(zhì)穩(wěn)定,反之則不穩(wěn)定),為穩(wěn)定類蛋白;總平均疏水性為-0.767,說明該蛋白為親水性蛋白。PxbHLH02蛋白等電點為10.59;不穩(wěn)定系數(shù)為53.02,為不穩(wěn)定類蛋白;總平均疏水性為-0.666,為親水性蛋白。2.2.2phxbhlh力學性能檢測蛋白蛋白質(zhì)親疏水性氨基酸的組成是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力,通過親水性預測可以反映蛋白質(zhì)的折疊情況。利用在線分析軟件ProtScale的KyteandDoolittle算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行親水/疏水性分析(>0.5區(qū)域為疏水區(qū),<-0.5區(qū)域為親水區(qū),介于+0.5~-0.5之間主要為兩性區(qū)域)。結(jié)果表明,PxbHLH01蛋白共有8個疏水區(qū)和10個親水區(qū)(見圖3A);PxbHLH02蛋白共有4個疏水區(qū)和9個親水區(qū)(見圖3B)。2.2.3ph和跨膜結(jié)構(gòu)信號肽是N端的一段氨基酸序列,指導分泌性蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上合成,在蛋白質(zhì)合成結(jié)束之前被切除,信號肽位于蛋白質(zhì)的N端,一般由16~26個氨基酸殘基組成,其中包括疏水核心區(qū)、信號肽的C端和N端。利用在線分析工具SignalP的神經(jīng)網(wǎng)絡算法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行預測。結(jié)果表明,PxbHLH01(見圖4A)和PxbHLH02(見圖4B)蛋白可能均不存在信號肽?？缒そY(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)與膜內(nèi)在蛋白的靜電相互作用和氫鍵鍵合相互作用與膜結(jié)合的一段氨基酸片段,一般由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成,主要形成α-螺旋。利用在線工具TMPred對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行跨膜結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明,PxbHLH01(見圖5A)和PxbHLH02(見圖5B)蛋白可能不存在跨膜結(jié)構(gòu)。2.2.5pxbhlh00蛋白亞細胞定位分析利用在線工具WoLFPSORT分別對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行亞細胞定位分析。PxbHLH01蛋白在細胞質(zhì)基質(zhì)得分為8.0;PxbHLH02蛋白在細胞質(zhì)基質(zhì)中得分為7.0。2.3pulh010蛋白的結(jié)構(gòu)應用GOR4對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析。PxbHLH01和PxbHLH02蛋白均是由α-螺旋(Alphahelix)、延伸鏈(Extendedstrand)、無規(guī)則卷曲(Randomcoil)所組成的,并且分布于整個蛋白。PxbHLH01蛋白由39.71%的α-螺旋、57.47%的無規(guī)則卷曲和8.82%延伸鏈組成(見圖6A);PxbHLH02蛋白由54.35%的α-螺旋、42.03%的無規(guī)則卷曲和3.62%延伸鏈組成(見圖6B)。2.4同源建模結(jié)果利用在線分析工具Swiss-Model,對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行三級結(jié)構(gòu)同源建模,用SwissPdbViewer軟件對建模結(jié)果進行處理。PxbHLH01蛋白同源建模結(jié)果如圖7A所示,PxbHLH02蛋白同源建模結(jié)果如圖7B所示。同時,利用軟件的α-碳與酰胺平面交角圖功能,可以找到1個殘基與1個特定平面的構(gòu)象角(二面角),通過分析二面角,可以判斷一個模型的質(zhì)量。對PxbHLH01(見圖8A)和PxbHLH02(見圖8B)蛋白的二面角分析結(jié)果表明,蛋白質(zhì)殘基位于核心區(qū)域,說明空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,所以同源建模的方法對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的氨基酸序列的建模結(jié)果可靠。2.5系統(tǒng)進化分析利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast對PxbHLH01和PxbHLH02基因序列以及推測的編碼蛋白進行同源序列比對,Blastp比對結(jié)果表明,PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊Populustrichocarpa(XP_002320968.1和XP_002301522.1)、擬南芥Arabidopsisthaliana(NP_566098.1)、大豆Glycinemax(XP_003556194.1)、玉米Zeamays(DAA58466.1)、水稻OryzasativaIndicaGroup(EAY87819.1)、葡萄Vitisvinifera(XP_003632412.1)、甘藍Brassicaoleraceavar.capitata(ADK56282.1)、苜蓿Medicagotruncatula(XP_003617449.1)、云杉Piceasitchensis(ADE76325.1)、高粱Sorghumbicolor(XP_002462412.1)和蓖麻Ricinuscommunis(XP_002515253.1)同源性較高,一致性分別為97%和76%、77%和97%、50%和45%、53%和54%、41%和41%、42%和35%、50%和57%、50%和24%、49%和48%、42%和44%、43%和43%、50%和57%。系統(tǒng)進化樹是物種的進化史,通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹可以根據(jù)這些物種的祖先描述它們的進化關(guān)系。先采用ClustalX對NCBI比對的氨基酸序列進行多序列比對的分析,然后利用MEGA5.0軟件,應用Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖9)。結(jié)果表明,12個物種的14條蛋白序列大致分為4個大類:其中小黑楊、毛果楊、蓖麻、葡萄、大豆、擬南芥和甘藍聚成一類,云杉、苜蓿和玉米聚成一類,水稻和高粱分別單獨聚成一類。PxbHLH01和PxbHLH02蛋白與毛果楊P.trichocarpa(XP_002301522.1和XP_002320968.1)有著較近的親緣關(guān)系。小黑楊、毛果楊等與擬南芥A.thaliana(NP_566098.1)的遺傳距離也較近,說明它們在進化上親緣關(guān)系較近;與水稻和高粱遺傳距離較遠,說明其親緣關(guān)系較遠。2.6基因啟動子中pxbh01和pxbh02的順序作用元素的確定和分析3pxbhd力學性能預測和生物生態(tài)學分析在擬南芥中,bHLH轉(zhuǎn)錄因子UPBEAT1(UPB1)通過直接調(diào)控一組氧化物酶來調(diào)控根部細胞增殖和分化之間的平衡。根據(jù)毛果楊序列設計引物克隆所獲得的PxbHLH01和PxbHLH02基因,經(jīng)多序列比對,結(jié)果表明與擬南芥編碼bHLH結(jié)構(gòu)域的功能蛋白UPBEAT1(UPB1)有較高同源性。為了鑒定PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的功能,通過在線工具對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白進行了預測和生物信息學分析。經(jīng)預測分析,結(jié)果表明PxbHLH01和PxbHLH02蛋白均為親水性蛋白質(zhì)。這2個蛋白可能不存在信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。這正與亞細胞定位預測結(jié)果相互印證,2個蛋白亞細胞定位預測是在細胞質(zhì)。這說明,PxbHLH01和PxbHLH02蛋白可能在細胞質(zhì)中起作用,而非分泌蛋白。對PxbHLH01和PxbHLH02蛋白的二級結(jié)構(gòu)的分析預測結(jié)果表明,2個蛋白都是由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲所組成的。通過對蛋白進行三級結(jié)構(gòu)的同源建模,繪制出2個蛋白可能的結(jié)構(gòu)模型(見圖7、8),表明了這2個基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)為bHLH(basiche