第七章雙水相萃取技術(shù)和反膠團萃取

溶液的分相不一定完全依賴于有機溶劑，在一定條件下，水相也可以形成兩相(即雙水相系統(tǒng))甚至多相。于是有可能將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)從一個水相轉(zhuǎn)移到另一水相中，從而完成分離任務(wù)。有機溶劑萃取的不足：許多蛋白質(zhì)都有極強的親水性，不溶于有機溶劑；蛋白質(zhì)在有機溶劑相中易變性失活。雙水相系統(tǒng)某些高聚物之間或高聚物與無機鹽之間在水中以適當?shù)臐舛热芙?，形成互不相溶的兩水相或多水相系統(tǒng)。雙水相體系簡介1896年Beijerinck觀察到當把明膠與瓊脂和可溶性淀粉的水溶液混合時先得到一個混不透明的溶液，隨之分為兩相，上相富含明膠，下相富含瓊脂（或淀粉），這種現(xiàn)象被稱之為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系。分相時間短(特別是聚合物/鹽系統(tǒng)),自然分相時間一般只有5～15min。目標產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于3,大多數(shù)情況下,目標產(chǎn)物有較高的收率。大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉,與其它常用固液分離方法相比,雙水相萃取技術(shù)可省去1～2個分離步驟,使整個分離過程更經(jīng)濟。設(shè)備投資費用少,操作簡單,不存在有機溶劑殘留問題。雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點一、雙水相分離理論1、雙水相的形成熵增——混合——自發(fā)分子間作用力------隨著Mr的增加而增大

聚合物的不相容性------含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象聚合物的不相溶性由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，當聚合物的濃度達到一定值時，就不能形成單一的水相，所以具有強烈的相分離傾向。某些聚合物的溶液與某些無機鹽的溶液相混合時，只要濃度達到一定值，也會形成兩相，即聚合物—鹽雙水相體系。常用聚合物：聚乙二醇－葡聚糖聚乙二醇－無機鹽系統(tǒng)無毒原則2、相圖雙水相的形成和定量關(guān)系可用相圖表示：臨界點(criticalpoint)：當系線長度趨于零時,兩相差別消失,任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為1。如C點。杠桿原理：均相區(qū)兩相區(qū)雙節(jié)線系線聚合物的分子量越高，相分離所需的濃度越低兩種聚合物的分子量相差越大，雙節(jié)線的形狀越不對稱。3、物質(zhì)在兩相中的分配

和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中的分配用分配系數(shù)K表示。

CTK=——CBCt、CB——分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度

K—與溫度、壓力以及溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。1）表面自由能的影響(大分子物質(zhì)表面性質(zhì)對K影響很大)2）表面電荷的影響(鹽效應(yīng)：兩相系統(tǒng)中如存在鹽,對K影響較大)3）綜合考慮（影響因素很多，單因素定量很困難，最佳操作條件靠實驗）4）影響分配平衡的參數(shù)

(1)聚合物的影響；(2)體系中無機鹽離子的影響；

(3)體系PH的影響；(4)體系溫度的影響；

(5)體系中微生物的影響。1）表面自由能的影響2）表面電荷的影響道南電位(,Donnanpotential):實際雙水相系統(tǒng)中有電解質(zhì),當這些離子在兩相中K

1,則兩相間產(chǎn)生電位差

U2，U1——相1和相2的電位

Z+,Z－——分別表示一種鹽的正負離子的離子價

F——法拉第常數(shù)

T——溫度進一步可證明：InKi*=InKi+

ZiF(U2-U1)RTKi*——i組分帶電時在體系中的分配系數(shù)

Ki——i組分不帶電時在體系中的分配系數(shù)

Zi——i組分的離子價意義：A

荷電溶質(zhì)的分配系數(shù)的對數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比.B由于同一雙水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的

不同,故k與Zi的關(guān)系因鹽而異。3）綜合考慮4）影響分配平衡的因素(1)聚合物的影響聚合物相對分子量的影響

當聚合物的分子量降低時，蛋白質(zhì)易分配于富含該聚合物的相。例如在PEG—DeX系統(tǒng)中，PEG的分子量減小，會使分配系數(shù)增大，而葡聚糖的分子量減小，會使分配系數(shù)降低。這是一條普遍的規(guī)律，不論何種成相聚合物系統(tǒng)都適用。成相聚和物濃度的影響

當接近臨界點時，蛋白質(zhì)均勻地分配于兩相，分配系數(shù)接近于1。

如成相聚合物的總濃度或聚合物／鹽混合物的總濃度增加時，系統(tǒng)遠離臨界點，系線的長度也增加，此時兩相性質(zhì)的差別也增大，蛋白質(zhì)趨向于向一側(cè)分配，即分配系數(shù)或增大超過1，或減小低于1。(2)體系中無機鹽離子的影響鹽離子在兩相中有不同的分配，在兩相間形成電位差，影響到帶電荷生物大分子的分配。鹽的種類對雙水相萃取也有一定的影響,因此變換鹽的種類和添加其他種類的鹽有助于提高選擇性在不同的雙水相體系中鹽的作用也不相同。在PEG/磷酸鹽/水中加入氯化鈉可以使萬古霉素的分配系數(shù)由4提高到120,而在PEG/DeX/水體系中只從1.55提高到5。(3)體系PH的影響pH會影響蛋白質(zhì)中可以離解基團的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)。pH也影響磷酸鹽的離解程度，若改變H2PO4-和HPO42-之間的比例，也會使相間電位發(fā)生變化而影響分配系數(shù)。pH的微小變化有時會使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變2—3個數(shù)量級。(4)體系溫度的影響

溫度影響小,一般溫度改變不影響產(chǎn)物的萃取。大規(guī)模操作一般在室溫下進行,不需冷卻。

(1)成相聚合物PEG對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用,常溫下蛋白質(zhì)不會發(fā)生變性; (2)常溫下溶液粘度較低,容易相分離; (3)常溫操作節(jié)省冷卻費用.

二、雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用1.雙水相萃取法常用于胞內(nèi)酶提取和精制已知的胞內(nèi)酶約2500種，但投入生產(chǎn)的很少。原因之一是提取困難。胞內(nèi)酶提取的第一步系將細胞破碎得到勻漿液，但勻漿液黏度很大，有微小的細胞碎片存在，欲將細胞碎片除去，離心分離是一種常用的方法，但非常困難。雙水相系統(tǒng)可用于細胞碎片以及酶的進一步精制。要成功地運用兩水相萃取的方法，應(yīng)滿足下列條件：欲提取的酶和細胞應(yīng)分配在不同的相中；酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時，經(jīng)過一次萃取，就能得到高的收率；兩相用離心機很容易分離。工程方面的問題

在進行工業(yè)應(yīng)用時，需考慮達到萃取平衡所需的時間和兩相分離的設(shè)備。

在兩水相系統(tǒng)中，雖黏度高，但表面張力很低。因而進行攪拌時很易分散成微滴，故幾秒鐘即能達到平衡，且能耗也很少。兩相分離則比較困難，這是由于兩相密度差低和當處理勻漿液時，粘度較大。由于粘度較高會引起阻塞，可采用自動排渣的噴嘴分離機。PEG/鹽更適合用重力沉降；PEG/DeX多用離心機。

在兩水相系統(tǒng)中進行轉(zhuǎn)化翻譯功能，如酶促反應(yīng)，可以把產(chǎn)物移入另一相中，消除產(chǎn)物抑制，因而提高了產(chǎn)率。這實際上是一種反應(yīng)和分離耦合的過程，有時也稱為萃取生物轉(zhuǎn)化；如果發(fā)生的是一種發(fā)酵過程，則也稱為萃取發(fā)酵，因而此時也可以把兩水相系統(tǒng)稱為兩水相反應(yīng)器。2.兩水相反應(yīng)器enzymeenzymeenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionsubstrateproductenzymeenzymeenzymeEnzymeticreactionwithATPS兩水相生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)應(yīng)滿足下列條件：催化劑應(yīng)單側(cè)分配；底物應(yīng)分配于催化劑所處的相中；產(chǎn)物應(yīng)分配在另一相中；要有合適的相比。如產(chǎn)物分配在上相中，則相比要大，反之則相比要小。這些條件不可能同時滿足，分配理論也不完善，常需要根據(jù)試驗選擇最優(yōu)系統(tǒng)和操作條件。三、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展

1.PEG衍生物：在PEG上引入親和基團或離子基團；

2.采用多級萃取。反膠團萃取發(fā)展歷史

1977年瑞典倫德大學(xué)Albertsson

首先提出反膠團萃取分離蛋白質(zhì)

20世紀80年代生物學(xué)家們開始認識到反膠團萃取的重要性國內(nèi)自20世紀80年代起也開展了反膠團萃取技術(shù)研究1、膠團與反膠團的形成

將表面活性劑溶于水中，當其濃度超過臨界膠團濃度(CMC)時，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起而形成聚集體，在通常情況下，這種聚集體是水溶液中的膠團，稱為正常膠團(normalmicelle)。膠團：表面活性劑的極性頭朝外，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”水非極性的“核”極性“頭”非極性“尾”若將表面活性劑溶于非極性的有機溶劑中，并使其濃度超過臨界膠團濃度(CMC)，便會在有機溶劑內(nèi)形成聚集體，這種聚集體稱為反膠團。反膠團：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”有機溶劑極性“頭”極性的“核”非極性“尾”膠團萃取過程用反膠團技術(shù)萃取蛋白質(zhì)時,用以形成反膠團的表面活性劑起著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)在多數(shù)研究者采用AOT(陰離子型)為表面活性劑。AOT是琥珀酸二(2-乙基己基)酯磺酸鈉或丁二酸二異辛酯磺酸鈉(AerosolOT)。溶劑則常用異辛烷

(2,2,4-二甲基戊烷)。形狀：通常為球形，也有的為橢圓形或棒形。大?。喊霃揭话銥?0nm，取決于反膠團的含水量W0。W0≌[H2O]/[Surf]

2、反膠團的形狀和大小3、反膠束的溶解作用微水池溶解和分離作用：

反膠團的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子,為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境.

反膠團萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。蛋白質(zhì)溶解模型

a、水殼模型：蛋白質(zhì)位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠團壁隔開；

b、半島模型：pro表面存在強烈疏水區(qū)，該區(qū)直接與有機相接觸；

c、pro吸附于反膠團內(nèi)壁；

d、pro疏水區(qū)與幾個反膠團的S疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個小反膠團所“溶解”。溶解作用機理A 靜電作用

當溶質(zhì)所帶電荷與表面活性劑相反時,由于靜電引力的作用,溶質(zhì)易溶于反膠團,溶解率或分配系數(shù)較大,反之,則不能溶解到反膠團相中。右圖：在帶正電荷的pH范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的溶解率接近100%,說明靜電相互作用對蛋白質(zhì)的反膠團萃取起決定性作用。B 空間相互作用

鹽濃度增大對反膠團相產(chǎn)生脫水效應(yīng),含水率W0隨鹽濃度的增大而降低,反膠團直徑減小,空間排阻作用增大,pro溶解下降.

在各pro的pI處，反膠團萃取實驗研究表明:隨著M增大,pro的分配系數(shù)(m,溶解率)下降。當M>20KD時,m很小.表明隨M增大,空間排阻作用增大,pro的溶解率降低.根據(jù)pro間M的差別可以選擇性對pro進行萃取分離。C 疏水性相互作用

aa的疏水性各不相同,研究表明,aa或多肽的m隨aa疏水性的增大而增大,蛋白質(zhì)的疏水性影響其在反膠團中的溶解形式,因而影響其分配系數(shù).4、反膠團的制備5、影響反膠團萃取蛋白質(zhì)的主要因素對于陽離子表面活性劑、溶液的pH值需高于蛋白質(zhì)的pI值，反膠團萃取才能進行；對于陰離子表面活性劑，當pH＞pI時，萃取率幾乎為零。水相pH值pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響離子種類影響含水率，隨反離子半徑的增大而下降。離子強度

a.離子強度增大后，反膠團內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠團內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度；b.

鹽濃度的增大，反膠團產(chǎn)