DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄

翻譯

核酸的分子雜交

基因結(jié)構(gòu)異常基因表達異常PCR

DNA測序

Nothern-blot

實時熒光定量PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR

蛋白質(zhì)芯片

ELISA

蛋白組織化學(xué)染色Western-blot基因芯片

基因診斷的技術(shù)和方法遺傳性疾病分子診斷嚴(yán)永敏基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院遺傳性疾病診斷策略

1.點突變的診斷

方法有等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特異性擴增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技術(shù)進行診斷；對于一些基因背景未知的點突變，可以采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測定、蛋白截短測試等方法。一、限制性內(nèi)切酶法（RE法）導(dǎo)致某一限制酶識別位點移位的大片段缺失或插入，

導(dǎo)致某一限制酶識別位點喪失或獲得的點突變，均可引起相應(yīng)限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化。分析限制性酶切圖，即可診斷出此類突變。×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析二、ASO探針雜交受檢者基因組DNA或含突變位點的PCR擴增產(chǎn)物與標(biāo)記的ASO探針雜交主要適用于檢測已知點突變ASO1ASO2NormalHeteroHomoPCR-SSCP2.片段性突變的檢測

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發(fā)生突變，如堿基的缺失、插入、擴增和重組。對于少數(shù)核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點突變的方法，而對于大的片段突變，則使用Southern印跡技術(shù)和多重PCR技術(shù)。杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥的基因診斷

多重PCR檢測患者缺失凝膠電泳圖（9對引物）P1除外顯子1外其余均缺失；P2外顯子8－19有小的缺失；P3外顯子44-50缺失；P4外顯子45－52有小的缺失；B1空白對照；C1、C2正常對照。遺傳性疾病診斷策略

DNA多態(tài)（DNAPolymorphism）：群體中每個個體DNA區(qū)域中等位基因（或片段）存在兩種或兩種以上的形式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態(tài)。它通過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標(biāo)記。將與致病基因連鎖的某種多態(tài)性標(biāo)志作為遺傳標(biāo)志，在同一個家系成員中探查是否存在致病基因的方法即為基因連鎖分析法。

基因連鎖分析常用的遺傳性多態(tài)性標(biāo)記有3類：1）RFLP：

稱限制性片段長度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性標(biāo)記；2）重復(fù)序列多態(tài)性（VNTR）：如短串聯(lián)重復(fù)序列（STR），為第二代多態(tài)性標(biāo)記；3）單核苷酸多態(tài)性（SNP）DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態(tài)性標(biāo)記。1Southernblot--RFLP診斷(PKU)間接基因診斷PAH基因兩側(cè)有Msp1酶切位點,用該酶消化可產(chǎn)生23kb、19kb兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交?；颊邽?9kb片段的純合子,說明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷數(shù)目變異串聯(lián)重復(fù)

variablenumbertandemrepeats,VNTR重復(fù)序列以各自的核心序列（重復(fù)單元），首尾相連多次重復(fù)，稱為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)即VNTR。散在分布于染色體上。重復(fù)單位6~25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復(fù)單位2~6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。VNTR兩側(cè)酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)不同，酶切后產(chǎn)生不同長度的片段。DNA多態(tài)可以通過PCR擴增后電泳來檢出，稱擴增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，電泳后的檢測結(jié)果

大小PCR-VNTR檢測PCR-VNTR成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病——APKD，AD，臨床表現(xiàn)為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結(jié)石。最終導(dǎo)致腎功能衰竭和尿毒癥。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和疾病發(fā)病機理也尚未闡明，但已證實APKDGene與α珠蛋白基因3`端附近的一段小衛(wèi)星DNA序列（3`HVR）緊密連鎖，因此，可以通過VNTR連鎖分析進行診斷。間接基因診斷以3`HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關(guān)成員的基因組DNA進行SouthernBlot

基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉(zhuǎn)膜探針變性雜交結(jié)果分析間接基因診斷1212345

5.7kb3.4kb2.3kb

間接基因診斷結(jié)果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，說明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產(chǎn)前診斷正常。間接基因診斷單核苷酸多態(tài)SingleNucleiotidePolymorphism，SNPSNP：發(fā)生在基因組中的單