觀賞植物花色基因工程研究進展

顏色是植物的一個重要品質(zhì)特征。狹義的顏色指的是花瓣的顏色。一般來說，花朵、雄蕊和菖蒲也可以用作花瓣（程金潮，2000）。花色的優(yōu)劣直接關(guān)系到觀賞植物的觀賞價值和商業(yè)價值,特別是近年來隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展,人們對花卉的需求也日益增加,那些具有新奇花色的觀賞植物具有廣闊的市場前景。自然界花卉顏色種類繁多,但是一些重要花卉的色系卻有限,如月季、香石竹、郁金香、菊花等缺乏藍色和紫色,天竺葵、仙客來、非洲紫羅蘭、翠菊等缺乏黃色,球根鳶尾、紫羅蘭等缺乏猩紅色或磚紅色,因此花色改良一直是育種工作者追逐的重要目標(biāo)。然而花色在生化和遺傳上都極為復(fù)雜,傳統(tǒng)育種技術(shù)在花色育種上就顯得力不從心。蓬勃發(fā)展的基因工程為觀賞植物花色的基礎(chǔ)研究和品種選育帶來新的思路和途徑。它可以導(dǎo)入控制某種(些)性狀的基因而擴大其基因庫,可以定向修飾觀賞植物的某個(些)性狀而不改變其原有性狀,因此可在保持原有性狀的基礎(chǔ)上,改變觀賞植物的花色,甚至創(chuàng)造該物種所不具有的花色,在較短時期內(nèi)培育出穩(wěn)定遺傳的新品種、新類型。觀賞植物花色基因工程較之其他作物基因工程有諸多優(yōu)點,首先由于花色素的明顯可見性,遺傳操作的檢測簡易;其次因其用作觀賞而非食用,因此安全性考慮較少;此外花色基因工程孕育著巨大的經(jīng)濟效益。因此它一方面是研究基因表達、調(diào)控和互作的熱點課題,另一方面又逐漸成為許多生物工程公司培育新奇花卉品種、創(chuàng)造經(jīng)濟效益的重點產(chǎn)業(yè)。近年來花色基因工程已取得了矚目的進展。1類黃酮copogmen花色是光線照射到花瓣上穿透色素層時,部分被吸收,部分被海綿組織反射折回,再度通過色素層而進入我們眼簾所產(chǎn)生的色彩。因此它與花瓣細胞中的色素種類、色素含量(包括多種色素的相對含量)、花瓣內(nèi)部或表面構(gòu)造引起的物理性狀等多種因素有關(guān),但花色素起主要作用。與花成色有關(guān)的色素包括葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮、水溶性生物堿及其衍生物四大類群,其中水溶性的類黃酮可產(chǎn)生從淺黃到藍紫的全部顏色范圍(鄭志亮,1996)。花的成色作用還受以下因素的影響:①細胞內(nèi)pH值:花瓣表皮細胞液泡pH值發(fā)生變化,常引起花色的改變,通常隨著pH值上升,顏色逐漸由紅變藍(鄭志亮,1996;邱輝龍和范明任,1998)。②分子堆積作用(molecularstacking):包括分子間堆積和分子內(nèi)堆積,分子間堆積包括花色苷的自連作用(self_association)和輔助著色作用(co_pigmentation),即花色苷與輔助色素(copigment)結(jié)合而呈現(xiàn)增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)及紅移(bathochromicshift),從而產(chǎn)生從紫到藍色色系的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象在pH1～7的范圍內(nèi)都可能發(fā)生,其產(chǎn)物對pH值的微小改變極其敏感(邱輝龍和范明任,1998;Tanakaetal,1998)。③螯合作用:色素常與細胞液中的Mg、Fe、Al、Mo等金屬離子螯合,螯合后花色在一定程度上有所改變,往往偏向紫色(鄭志亮,1996)。④花瓣表皮細胞的形狀:細胞形狀有利于增加細胞對入射光吸收的花,產(chǎn)生較深的色澤;反之,則產(chǎn)生明亮的外觀(邱輝龍和范明任,1998)。2香石竹dfr、anas的結(jié)構(gòu)及分類四大類色素都為次生代謝物,其合成涉及多個代謝步驟,由多種酶催化,因而與之相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及調(diào)節(jié)基因也較多,它們的作用機理十分復(fù)雜。目前對植物中普遍存在的花色苷的合成途徑以及與之相關(guān)的基因研究較為深入(Tanakaetal,1998)。花色苷合成的第一種關(guān)鍵酶是苯基苯乙烯酮(又稱查爾酮)合酶(chalconesynthase,CHS),它與某些縮合酶(condensingenzyme)具有同源性,如擬南芥的FAE1和酮酯?；?ketoacyl_acyl)載體蛋白合酶。黃烷酮_3_羥化酶(flavanone3_hydroxylase,F3H)是一種酮戊二酸依賴性的過氧化物酶,催化二氫黃烷酮(naringenin)生成二氫堪非醇(dihydrokaempferol,DHK,又稱二氫黃酮醇,dihydroflavonol)。類黃酮_3′_羥化酶(flavonoid3′_hydroxylase,F3′H)和類黃酮_3′,5′_羥化酶(flavonoid3′,5′_hydroxylase,F3′5′H)屬于同一細胞色素P450家族,它們決定二氫堪非醇B環(huán)的羥化模式,并最終決定產(chǎn)生花色的花色苷結(jié)構(gòu),F3′5′H是合成藍色的花翠素_3_葡萄糖苷的關(guān)鍵酶。二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol4_reductase,DFR)是催化DHK、DHQ(二氫櫟皮黃酮)、DHM(二氫楊梅黃酮)分別形成無色花葵素、花青素、花翠素的關(guān)鍵酶,它可能屬于3β_羥基甾體脫氫酶或DFR超家族。不同來源的DFR對三種底物的親和性有所差異,如矮牽牛DFR主要催化DHM,其次是DHQ,而對DHK則無作用(吳少華和張大生,2002)。Jonson等(2001)鑒定了DFR與底物專一性結(jié)合有關(guān)的區(qū)域,并通過改變該區(qū)域的一個氨基酸使DFR優(yōu)先催化DHK。無色花色素在花色素合酶(anthocyanidinsynthase,ANS)催化下產(chǎn)生有色花色素。DFR、ANS與花色的產(chǎn)生直接相關(guān),香石竹DFR、ANS基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著花色從粉至紅顏色加深而提高(Matoetal,2001)。類黃酮_3_O_糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid3_O_glycosyltransferase3GT)催化花色素的糖苷化,但在矮牽牛中發(fā)現(xiàn)一種不同于其他3GT的黃酮醇_3_O_半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonol3_O_galactosyltransferase,F3GalTase),其僅存在于花粉,催化發(fā)芽所需的黃酮醇的糖苷化(Milleretal,2002)。3色彩育種手術(shù)3.1顏色基因的類型與克隆3.1.1類黃酮合成基因花色基因包括花色素基因、花色素量基因、花色素分布基因、輔助色素基因、轉(zhuǎn)座子基因、控制花瓣內(nèi)部酸度的基因等。Forkmann(1991)將這些花色基因分為以下幾類:①控制類黃酮生物合成單個步驟的基因;②與類黃酮修飾有關(guān)的基因;③開關(guān)全部或部分合成途徑的調(diào)節(jié)基因;④影響類黃酮濃度的基因;⑤與花朵結(jié)構(gòu)有關(guān)的基因;⑥影響花色的基因或因子;⑦控制花瓣毛、乳突、色素細胞的形狀和分布、角質(zhì)層類型等形態(tài)特征的基因。3.1.2花色苷調(diào)節(jié)基因花色基因工程的第一步是花色苷生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的克隆。目前,利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽、PCR、蛋白質(zhì)純化與差異篩選等方法,已分離、克隆了多種花色苷結(jié)構(gòu)基因。矮牽牛編碼F3′5′H的基因Hf1和Hf2的表達均能使花色苷生物合成途徑趨向于產(chǎn)生藍色的花翠素_3_葡萄糖苷,從而使花趨于顯藍色。澳大利亞Florigene公司和日本Sandory公司的研究人員將矮牽牛F3′5′H和DFR基因?qū)肴狈FR的白色香石竹,培育出紫色品種‘Moondust’,現(xiàn)已在兩個國家銷售,成為第一例上市的轉(zhuǎn)基因花卉作物(Meyeretal,1987)。調(diào)節(jié)基因影響著結(jié)構(gòu)基因的表達方式和表達強度,花色苷生物合成的每一步酶促反應(yīng)均是調(diào)節(jié)基因作用的靶位點。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等技術(shù)現(xiàn)已分離出兩類花色苷調(diào)節(jié)基因:一類是myc型轉(zhuǎn)錄因子,如玉米的R基因家族(R、S、Sn、Lc基因)和金魚草Delila基因;另一類是myb型轉(zhuǎn)錄因子,如玉米的C1、Pl、P、Vp1基因(包滿珠,1997;余迪求和李寶健,1997)。Goff等認為這兩類轉(zhuǎn)錄因子相互作用激活結(jié)構(gòu)基因的表達。不同植物的花色苷合成調(diào)節(jié)基因在功能上具有保守性,其中某些調(diào)節(jié)基因可在外源物種中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。將玉米Lc基因?qū)霟煵?引起其花色由粉紅變?yōu)樯罴t。玉米B_Peru基因(myc型)轉(zhuǎn)入白三葉(Trifoliumrepenscv.Haifa)引起其葉片著色方式的改變,且這種變化可穩(wěn)定遺傳(Majniketal,2000)。隨著花色研究的深入,逐步明確了其他與花成色有關(guān)的基因功能,并克隆了其中一部分基因。部分已分離的花色基因如表1。3.2生物酶制劑的使用因為花色往往由多個代謝步驟、多基因決定,所以利用基因工程技術(shù)修飾這一性狀的一個重要策略是還原法(reductionapproach),即欲修飾某個性狀時,首先要明確決定該性狀的特異生化物質(zhì),然后對形成該生化物質(zhì)的代謝途徑進行基因工程操作,具體就是分析催化各反應(yīng)步驟的酶、編碼這些酶的基因及其表達調(diào)控(傅榮昭,1995)。多步驟的代謝途徑有限速步驟,而限速步驟對整個代謝途徑起著決定性作用,所以對限速步驟的遺傳操作往往是還原法的重要突破口。增強某種關(guān)鍵酶的表達,往往可使花色苷合成途徑朝生成其催化產(chǎn)物的方向進行,而抑制該酶的表達,則會使反應(yīng)朝合成途徑的另一分支進行,導(dǎo)致另一種產(chǎn)物的積累。因此增強F3′5′H、DFR的表達分別是培育藍花和磚紅色花品種的一個切入點。3.3色彩檢測的方法3.3.1chs基因突變植株利用基因工程技術(shù)進行花色修飾的常用方法是反義抑制法(或稱反義RNA法,AntisenseSuppression),即首先明確決定花色的特異生化物質(zhì),然后分析該生化物質(zhì)代謝途徑中催化各反應(yīng)步驟的酶,克隆編碼這些酶的基因,反向轉(zhuǎn)入到目的植株中,外源DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與內(nèi)源的互補mRNA結(jié)合,從而抑制目的植株中這些生化物質(zhì)的合成,產(chǎn)生花色突變(何小玲和王金發(fā),1998)。利用該技術(shù)已在矮牽牛(Vanetal,1988)、菊花(Guttersonetal,1994)等幾種觀賞植物中進行了成功的花色修飾。1988年VanderKrol等首次將反義CHS基因?qū)氚珷颗Ｖ?可抑制花色苷的形成,引起花色改變。反義CHS基因?qū)敕侵蘧?導(dǎo)致花瓣著色異常(Elomaaetal,1993)。Gutterson等通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法,將一個從菊花中分離到的CHS基因,以反義和正義方向分別導(dǎo)入開粉紅色花的菊花中,獲得開淺紅色和白色花的轉(zhuǎn)基因植株,對照組沒有白色花,進一步研究表明,轉(zhuǎn)基因植株的開白花性狀通過營養(yǎng)繁殖絕大多數(shù)能穩(wěn)定遺傳。Aida等(2000)用相同的方法將CHS或DFR基因?qū)胨{豬耳(Toreniahybrida),結(jié)果反義方向?qū)氲霓D(zhuǎn)化株花色均一變亮,而正義方向?qū)氲霓D(zhuǎn)化株花色不均一變亮。目前反義RNA技術(shù)的機理尚未明了,可能是作用于基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平。3.3.2．有利于抑制內(nèi)源基因的表達共抑制法(cosuppression),又稱有義抑制法(sensesuppression),即正向?qū)胍粋€(或幾個)內(nèi)源基因的額外拷貝,反而抑制該內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的積累,進而抑制該內(nèi)源基因的表達(Napolietal,1990;Rjorgensenetal,1995)。該技術(shù)在矮牽牛(傅榮昭,1995)、菊花(Guttersonetal,1994)、藍豬耳(Suzukietal,2000)等花卉的花色修飾方面已取得成功。共抑制引起花色多樣性的分子機制尚不清楚,初步分析認為,同源順序的存在可能是產(chǎn)生共抑制效應(yīng)的基礎(chǔ),它與反義RNA的作用機制可能有某些共同之處,即都存在基因互作效應(yīng)(洪孟民,1994)。3.3.3矮牽?；ㄩ_磚紅色花即將欲修飾的供試株及其近緣種植物中原先不具有的一個(或幾個)基因?qū)肫渲?從而使該受體植物增加一個(或幾個)新的性狀。Meyer等(1987)首次將源自玉米的編碼DQR的A1基因?qū)氚珷颗０谆ㄍ蛔凅w中,產(chǎn)生了開磚紅色花的矮牽牛。薔薇缺乏編碼合成藍色色素——花翠素的關(guān)鍵酶F3′5′H的基因,1992年,澳大利亞CalgenePacific公司與日本Sundory公司合作向薔薇中導(dǎo)入該基因獲得成功,同年該公司在矮牽牛中導(dǎo)入該基因獲得藍色矮牽牛(蘇煥然等,1996)。3.3.4花的調(diào)節(jié)基因此外,在花色基因工程操作中,也可以導(dǎo)入調(diào)節(jié)基因以增強或減弱原有代謝產(chǎn)物表達,或?qū)肫渌c花成色作用有關(guān)的基因,如ph基因、輔助色素基因、細胞形狀基因等,也可以同時導(dǎo)入與某種花色有關(guān)的多種基因。Quattrocchio等(1993)將一系列花色苷合成的調(diào)節(jié)基因?qū)氚珷颗?獲得粉色花。Kim(2001)將玉米C1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草,轉(zhuǎn)化株花瓣變狹長,顏色顯著變淺。多基因同時導(dǎo)入對培育藍色月季具有重要利用價值,因為藍色月季須具備三個條件:花翠素、輔助色素黃酮醇、較高的pH值,目前Suntory公司和CalgenePacific公司等正在進行這項工作。4我國觀賞植物結(jié)構(gòu)基因研究的現(xiàn)狀21世紀花卉業(yè)競爭是品種和技術(shù)的競爭,掌握豐富的資源和先進的技術(shù),勢必會在競爭中處于主動地位。近十年來,花卉基因工程的發(fā)展正日益加快,很有可能給花卉業(yè)帶來革命性的影響?；ɑ軜I(yè)發(fā)展水平較高的發(fā)達國家早已意識到要占領(lǐng)國際市場就必須不斷地培育出更新穎、更美麗的花卉品種,觀賞植物的基因工程為此帶來希望和契機。發(fā)達國家已在觀賞植物的花色基因工程上開展了大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究,并取得了有效的成績,具備明顯的競爭優(yōu)勢。我國在