第七章微生物的遺傳變異和育種目的與要求：本章主要使學生了解微生物遺傳因子的構(gòu)成、理解其中的概念、術(shù)語，掌握基因突變的特點、重要類型，誘變育種的操作過程，理解并掌握原核、真核生物基因重組和雜交育種的原理及方法。重點、難點（1）基因突變的特點及重要類型（2）證明基因突變自發(fā)性和不對稱性的的原理（3）誘變育種的原理、方法及操作過程（4）基因重組及雜交育種的類型、原理遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一遺傳型：表型：生物的全部遺傳因子所攜帶的遺傳信息具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的外表特征和內(nèi)在特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

微生物是遺傳學研究中的明星？第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)一、證明核酸是遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的三個經(jīng)典實驗（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗（transformation）：F.Griffith（二）噬菌體感染實驗：A.D.Hershey和M.Chase（三）植物病毒的重建實驗：H.Fraenkel-Conrat（1）動物實驗混合培養(yǎng)SIII型活菌SIII型熱死菌RII型活菌SIII型活菌健康健康健康健康健康病死病死病死Griffith轉(zhuǎn)化試驗示意（2）細菌培養(yǎng)實驗（3）S型菌的無細胞抽提液試驗熱死SIII菌—————不生長

活RII

菌—————長出RII菌

熱死SIII菌—————長出大量RII菌和10-6SIII菌活R菌+S菌無細胞抽提液——長出大量R菌和少量S菌+活RII菌平皿培養(yǎng)1944年，Avery精確重復了轉(zhuǎn)化實驗，確定了轉(zhuǎn)化因子實驗證明，將R菌轉(zhuǎn)化為S菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA（二）噬菌體感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以32S標記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實驗（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性（三）植物病毒的重建實驗因此:只有核酸（DNA、RNA）才是負載遺傳信息的真正物質(zhì)基礎(chǔ)。二、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的部位和方式細胞水平：存在于細胞核或核區(qū)細胞核水平:

原與真核生物的細胞核結(jié)構(gòu)不同，(核仁、固定形態(tài)、與組蛋白結(jié)合）核外DNA染色體水平:

不同生物染色體數(shù)p193染色體倍數(shù)：同一細胞中相同染色體的套數(shù)核酸水平：DNA或RNA，復合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：基因：生物體內(nèi)，一切具有自主復制能力的最小遺傳功能單位，它的物質(zhì)基礎(chǔ)是一個具特定核苷酸順序的核酸片段，大小為1000-1500bp功能：表達和產(chǎn)生基因產(chǎn)物原核生物基因的表達通過組成操縱子形式：命名原核生物的基因結(jié)構(gòu)的特點：1）染色體為雙鏈環(huán)狀的DNA分子（單倍體）；2）基因組上遺傳信息具有連續(xù)性；3）功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因組成操縱子結(jié)構(gòu)；4）結(jié)構(gòu)基因的單拷貝及rRNA基因的多拷貝；5）基因組的重復序列少而短；真核微生物（啤酒酵母）的基因結(jié)構(gòu)的特點：1）基因的非連續(xù)性

2）沒有明顯的操縱子結(jié)構(gòu)

3）轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯有空間間隔

4）重復序列多密碼子水平：遺傳密碼：指DNA鏈上決定各具體氨基酸的特定核苷酸排列順序。 密碼子：信息單位核苷酸水平：

最低突變或交換單位，四種核苷酸核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質(zhì)粒”原核生物的質(zhì)粒 線粒體細胞質(zhì)基因 葉綠體（質(zhì)體） 卡巴顆粒酵母菌的2m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒三、原核生物的質(zhì)粒質(zhì)粒（plasmid）：獨立于核基因組外，能自主復制的小型共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子（一

）質(zhì)粒的分子構(gòu)型通常以共價閉合環(huán)狀(covalentlyclosedcircle，簡稱ccc)的超螺旋雙鏈DNA分子存在于細胞質(zhì)中；也發(fā)現(xiàn)有線型雙鏈DNA質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒（二）典型質(zhì)粒質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應F質(zhì)粒（Fertilityplasmid

，F(xiàn)因子）R質(zhì)粒（Resistanceplasmid

，R因子）Col質(zhì)粒（colicinplasmid）Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid）Ri質(zhì)粒（rootinducingplasmid)巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒P199-201(三)質(zhì)粒的主要生物學性質(zhì)1、質(zhì)粒的自我復制2、質(zhì)粒的存在形式：獨立存在、附加體3、質(zhì)粒攜帶的基因4、質(zhì)粒的親和性和不親和性5、有的質(zhì)粒具有轉(zhuǎn)移性6、拷貝數(shù)嚴緊型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒三、質(zhì)粒在基因工程中的應用

質(zhì)粒在基因工程操作中的優(yōu)點：1.體積小，便于DNA的分離和操作；2.呈環(huán)狀，在化學分離過程中能保持穩(wěn)定性；3.有不受核基因組控制的獨立復制起始點；4.拷貝數(shù)多，使外源DNA可快速擴增；5.存在抗藥性基因等選擇性標記，便于含質(zhì)?？寺〉臋z出和選擇。E.Coli

的PBR322質(zhì)粒第二節(jié)基因突變和誘變育種基因突變(genemutation)指細胞(或毒粒)內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。突變的原因：自發(fā)突變、誘變基因突變狹義：點突變廣義：基因突變和染色體畸變突變株（mutant）：野生型（wildtype）：一、基因突變的類型按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細胞來分：選擇性突變株（selectivemutant）：1.營養(yǎng)缺陷型（auxotroph）2.抗性突變型3.條件致死突變型非選擇性突變株（non-selectivemutant）：4.形態(tài)突變型5.抗原突變型6.產(chǎn)量突變型（二）突變率定義：每一細胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來表示。突變率=突變細胞數(shù)/分裂前群體細胞數(shù)（三）基因突變的特點1、自發(fā)性：2、不對應性：3、稀有性：4、獨立性：5、可誘變性：6、穩(wěn)定性：7、可逆性：（四）基因突變的自發(fā)性和不對應性的證明1.變量試驗fluctuationtest2.涂布試驗3.平板影印培養(yǎng)試驗（replicaplating）變量試驗又稱波動試驗或彷徨試驗。

1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根據(jù)統(tǒng)計學原理，設(shè)計了左方的實驗。1.變量試驗fluctuationtest2.Newcombe涂布試驗原理與變量試驗相同，方法更為簡便，且可計算突變率。3.平板影印培養(yǎng)試驗（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫婦的論文《平板影印培養(yǎng)法和細菌突變株的間接選擇》平板影印培養(yǎng)法（五）基因突變的機制基因突變的具體類型可歸納如下：1、誘變機制誘發(fā)突變：利用物理、化學、生物的因素，提高突變率的人為的作法誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何理化生物因子（1）堿基置換（substitution）定義：屬于一種染色體的微小損傷（microlesion它只涉及一對堿基被另一對堿基所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transversion直接引起置換的誘變劑定義：一類可直接與核酸的堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，從而引起DNA復制時堿基配對的轉(zhuǎn)換，并進一步使微生物發(fā)生變異。這類誘變劑主要是一些堿基類似物

,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5—AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等；

作用方式：通過活細胞的代謝活動參入到DNA分子中，主要是在DNA復制時堿基類似物插入DNA中，引起堿基對配對錯誤，造成堿基置換。間接引起置換的誘變劑（2）移碼突變frame-shiftmutation

指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個或少數(shù)幾個核苷酸，從而使該基因該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的一類突變。吖啶類染料，包括原黃素、吖啶黃、吖啶橙和α-氨基吖啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物吖啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復突變圖示：（3）染色體畸變（chromosomalaberration）某些理化因子，還會引起DNA的大損傷（macrolesion）——染色體畸變，它包括：染色體結(jié)構(gòu)上的變化：缺失（deletion）重復（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化轉(zhuǎn)座（transposition）轉(zhuǎn)座：

DNA序列通過非同源重組的方式，從染色體的某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體的不同部位或不同的染色體上某一部位的現(xiàn)象專座因子：具有轉(zhuǎn)座作用的這段DNA序列，也稱作跳躍基因（jumpinggene）或可移動基因（movablegene）轉(zhuǎn)座因子的種類：插入序列（IS，insertionsequence）：轉(zhuǎn)座子（Tn，transposon）Mu噬菌體（即mutatorphage）轉(zhuǎn)座因子特點：非同源重組的方式轉(zhuǎn)移到染色體的新部位兩端各有一段末端重復序列具有轉(zhuǎn)座酶基因2、自發(fā)突變：無人為因素下的低頻率突變其原因：（1）背景輻射和環(huán)境因素引起（2）有害產(chǎn)物積累（3）堿基錯配（六）紫外線對DNA的損傷及其修復嘧啶嘧啶二聚體UV1、光復活作用嘧啶二聚體嘧啶光解酶2、切除修復（一）自發(fā)突變與育種1、從生產(chǎn)中育種如：抗噬菌體感染，“上酒白種”．2、定向培育優(yōu)良菌株（“馴化”）如：炭疽活菌疫苗，卡介苗．（二）誘變育種誘變育種是指利用物理、化學等誘變劑處理均勻而分散的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學實驗或生產(chǎn)實踐使用。二、突變與育種1、誘變育種的基本原理和環(huán)節(jié)：2、誘變育種的一般步驟出發(fā)菌株↓純化、活化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液↓離心收集細胞、洗滌，制備均一的菌懸液（玻璃株打散、過濾）單細胞或單孢子懸液↓活菌計數(shù)，誘變預備試驗誘變處理↓活細胞計數(shù)，致死率計算中間培養(yǎng)(后培養(yǎng))↓平板分離↓變異率計算初篩→復篩→保藏及擴大試驗1）選擇簡便有效的誘變劑2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（originalstrain）3）處理單細胞或單孢子懸液4）選用最適的誘變劑量5）充分利用復合處理的協(xié)同效應（synergism）6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標7）設(shè)計高效篩選方案（篩選比誘變更重要）8）創(chuàng)造新型篩選方法3、誘變育種中的幾個原則誘變育種的主要環(huán)節(jié)：誘變和篩選（1）誘變紫外誘變方法:設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等紫外燈：波長為253.7nm,功率是15W處理時的照射距離：20cm—30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：用死亡率（70%—75%）表示照射劑量化學誘變劑：NTG檢測化學誘變劑的操作Ames試驗：是一種利用細菌營養(yǎng)缺陷型的回復突變來檢測環(huán)境和食品中是否存在化學致癌劑的簡便有效方法。原理：原因：化學藥劑對細菌的誘變率與其對動物的致癌性成正比，超過95%的致癌物質(zhì)對微生物有誘變作用，90%以上的非致癌物質(zhì)對微生物沒有誘變作用Ames試驗的操作：（2）菌種篩選1、初篩和復篩兩步進行初篩的目的：以量為主（選留有生產(chǎn)潛力的菌株）復篩的目的：復篩以質(zhì)為主，應精確測定生產(chǎn)潛力較大的每個菌株的生產(chǎn)指標，確認符合要求的菌株2、以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的篩選過程如下：第一輪：一個出發(fā)菌株→→→選出200個菌株→→→選出50株→→→選出5株誘變處理初篩（每瓶一株）復篩（每瓶四株）第二輪：5個出發(fā)菌株→→→→→→選出50株→→→選出5株40株40株40株40株40株誘變處理初篩復篩（每瓶一株）（每瓶四株）誘變處理3、變異菌的一般篩選方法平皿快速檢測法變色圈法透明圈法生長圈法抑菌圈法梯度平板法搖瓶培養(yǎng)法4、特殊變異菌的篩選方法：（1）產(chǎn)量突變株的篩選

瓊脂塊培養(yǎng)法（2）抗藥性突變株的篩選

梯度平板法（3）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

a.與營養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的概念：野生型：營養(yǎng)缺陷型：原養(yǎng)型：基本培養(yǎng)基：完全培養(yǎng)基:補充培養(yǎng)基;營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型鑒定營養(yǎng)缺陷型富集培養(yǎng)（抗生素法）（菌絲過濾法）夾層培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法逐個檢出法影印平板法生長譜法第三節(jié)基因重組和雜交育種基因重組（generecombination）：兩個獨立基因組內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成穩(wěn)定的新遺傳型的過程重組與雜交的關(guān)系：基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。一、原核微生物的基因重組基因重組的方式：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導接合原生質(zhì)體融合（一）轉(zhuǎn)化（transformation）1、轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)：定義：感受態(tài)受體菌直接攝取來自供體菌的游離DNA片段，經(jīng)重組而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子（transformant）。發(fā)現(xiàn)：R型活菌+S型死菌→→S型活菌2、轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件①受體細胞要處于感受態(tài)（competence）.②外源游離DNA分子（轉(zhuǎn)化因子）③菌株間的親緣關(guān)系密切3、感受態(tài)細胞形成的方式：自然感受態(tài)人工感受態(tài)感受態(tài)因子：調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白質(zhì)，主要包括膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細胞壁自溶素和幾種核酸酶。4、轉(zhuǎn)化的過程以S.Pneumoniaestr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段：吸附：切割：入胞：重組：復制：轉(zhuǎn)化子形成：轉(zhuǎn)化的過程strr5、轉(zhuǎn)染（transfection）定義：把噬菌體或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細胞或原生質(zhì)體，并進而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。與轉(zhuǎn)化的區(qū)別：病毒或噬菌體核酸并非作為供體基因的功能中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合最后不產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子（二）細菌的轉(zhuǎn)導（transduction）1.轉(zhuǎn)導及其發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導：由缺陷噬菌體介導的，把供體細胞的小片段DNA攜帶進受體細胞中進行遺傳交換與整合使受體細胞獲得前者部分遺傳形狀的現(xiàn)象J.Lederberg等（1952）在Salmonellatyphimurium（鼠傷寒沙門氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。AB[-][-]Try+his+Try-his+Try+his-2.轉(zhuǎn)導的種類轉(zhuǎn)導普遍轉(zhuǎn)導局限轉(zhuǎn)導完全普遍轉(zhuǎn)導流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導低頻轉(zhuǎn)導高頻轉(zhuǎn)導（1）普遍性轉(zhuǎn)導（generalizedtransduction）定義：通過極少數(shù)完全缺陷噬菌體對供體菌任何DNA小片段的“誤包”而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象媒介：溫和噬菌體（P22噬菌體）分類：完全普遍轉(zhuǎn)導流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導完全普遍轉(zhuǎn)導的過程進入受體的外源DNA通過與細胞染色體的重組交換而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導子流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導（abortivetransduction）概念：

受體菌經(jīng)轉(zhuǎn)導獲得的供體DNA片段在受體菌中不發(fā)生配對交換和整合、復制，也不迅速消失，而只是進行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯（性狀表達），這種現(xiàn)象就稱為流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導。現(xiàn)象：進行細胞分裂時，只能將這段外源DNA分配給一個子細胞。流產(chǎn)普遍性轉(zhuǎn)導的過程（2）局限性轉(zhuǎn)導定義：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者基因組整合、重組形成轉(zhuǎn)導子的現(xiàn)象。分類：低頻轉(zhuǎn)導與高頻轉(zhuǎn)導低頻轉(zhuǎn)導高頻轉(zhuǎn)導雙重溶源菌溫和噬菌體λ裂解時的不正常切割：包含gal或bio基因缺陷噬菌體DNA分子在宿主細胞內(nèi)能夠象正常的λDNA分子一樣進行復制、包裝，提供所需要的裂解功能，形成轉(zhuǎn)導顆粒，但沒有正常噬菌體的溶源性和增殖能力，感染受體細胞后，通過DNA整合進宿主染色體而形成穩(wěn)定的局限轉(zhuǎn)導子。低頻轉(zhuǎn)導低頻轉(zhuǎn)導裂解物正常噬菌體極少量的部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導噬菌體）轉(zhuǎn)導顆粒局限轉(zhuǎn)導子（極少量）低感染復數(shù)高頻轉(zhuǎn)導低頻轉(zhuǎn)導裂解物正常噬菌體極少量的部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導噬菌體）轉(zhuǎn)導顆粒高感染復數(shù)雙重溶源菌缺陷噬菌體和正常噬菌體同步復制高頻轉(zhuǎn)導裂解物部分缺陷噬菌體（局限轉(zhuǎn)導噬菌體）正常噬菌體等量轉(zhuǎn)導顆粒局限轉(zhuǎn)導子（大量）低感染復數(shù)E.coli

K12(

)gal+(供體菌)(大量)+dgal+（10-5）E.coliK12Sgal-(受體菌)E.coliK12Sgal-/

dgal+E.coliK12Sgal-/

dgal+/

E.coliK12Sgal-/

dgal+/

（雙重溶源菌供體）

(50%)+dgal+（50%）E.coliK12Sgal-(受體菌)E.coliK12Sgal-/

dgal+（轉(zhuǎn)導子）

（雙重容源轉(zhuǎn)導子）高頻轉(zhuǎn)導和低頻轉(zhuǎn)導圖解低頻轉(zhuǎn)導高頻轉(zhuǎn)導U.V.U.V.普遍性轉(zhuǎn)導與局限性轉(zhuǎn)導的異同

相同點：均以噬菌體為媒介，導致遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。 不同點： 普通性轉(zhuǎn)導局限性轉(zhuǎn)導