細(xì)菌和細(xì)菌rada基因的突變體對rda的敏感性

rad蛋白是rad51的一個(gè)超家型。這類超家型通常存在于細(xì)菌、老細(xì)菌和真核細(xì)胞中。與細(xì)菌中的rad蛋白相比，這一古老的細(xì)胞蛋白和真核細(xì)胞的rad51蛋白在多個(gè)區(qū)域內(nèi)的搜索和交換反應(yīng)中起著重要作用。與細(xì)菌中的rad蛋白相比，古細(xì)胞rad蛋白的氨基酸序列和真核細(xì)胞rad51蛋白的氨基酸序列更為相似。古細(xì)胞rad蛋白和細(xì)菌中的reca蛋白具有相似的功能，在群落重組和對dna損傷的恢復(fù)過程中也起著重要作用。真核細(xì)胞的rad51細(xì)胞有一個(gè)非常保守的心臟區(qū)域，而細(xì)菌的reca蛋白則沒有。然而，對于rad51、細(xì)菌rad5和c-末年的細(xì)菌，rad51的蛋白可以用作一個(gè)復(fù)合詞的雙鏈dna。真核細(xì)胞中的rad51蛋白可以與其他蛋白相互作用，如rad2、rad54、rad55、57、p53、rad1和rad2。人類rad51基因的第一階段組成了一個(gè)dna組合區(qū)域。該結(jié)構(gòu)區(qū)可以具有細(xì)菌rad-末端結(jié)構(gòu)區(qū)的功能，但它們之間沒有結(jié)構(gòu)同源性。大腸桿菌RadA首次被發(fā)現(xiàn),是由于這個(gè)基因的突變增加了大腸桿菌對γ射線輻照的敏感性.大腸桿菌radA基因的突變輕微降低了大腸桿菌對紫外線和γ射線輻照的抗性.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),它參與了復(fù)制叉遷移過程.以上結(jié)果說明,大腸桿菌RadA蛋白參與了同源重組過程.耐輻射奇球菌具有超強(qiáng)的輻射抗性,對其他DNA損傷因子也具有很強(qiáng)的抗性,如紫外線、過氧化氫和干燥.這種超強(qiáng)的輻射抗性是由于它具有不同尋常的染色體結(jié)構(gòu)以及高效的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)[23～25].在所有的DNA損傷類型中,雙鏈DNA斷裂對于細(xì)胞的生存是致命的.在大腸桿菌中,雙鏈DNA斷裂的修復(fù)過程是RecA依賴的,并且需要其他途徑的參與,如RecBCD和RecFOR途徑.耐輻射奇球菌不具有完整的RecBCD途徑,只有一個(gè)RecD類似的亞基,然而它具有完整的RecFOR途徑.研究表明,耐輻射奇球菌RecA蛋白具有大腸桿菌RecA的所有3種活性,但它利用與大腸桿菌RecA蛋白相反的機(jī)制進(jìn)行DNA鏈交換反應(yīng).利用PSI-BLAST方法,我們發(fā)現(xiàn),與古細(xì)菌和真核細(xì)胞中的RadA氨基酸序列相比,耐輻射奇球菌RadA蛋白的氨基酸序列與細(xì)菌中的RadA氨基酸序列更相似.到目前為止我們?nèi)匀徊恢滥洼椛淦媲蚓鶵adA蛋白是否也參與了同源重組過程.本研究利用反向插入突變的方法構(gòu)建了耐輻射奇球菌radA突變體,并研究了耐輻射奇球菌RadA蛋白可能的生物學(xué)功能.結(jié)果表明,耐輻射奇球菌RadA蛋白參與了DNA損傷修復(fù)過程而且它不同的結(jié)構(gòu)域行使不同的功能.1rada突變體的構(gòu)建(ⅰ)菌株、質(zhì)粒及生長條件.本研究涉及的所有菌株和質(zhì)粒見表1.耐輻射奇球菌培養(yǎng)于30℃TGY液體培養(yǎng)基或含1.5%瓊脂的固體培養(yǎng)基.大腸桿菌的DH5α菌株購自Invitrogen(LaJolla,CA)公司,培養(yǎng)于37℃LB液體或固體(含1.5%瓊脂)培養(yǎng)基.抗生素在需要時(shí)以合適的濃度添加到培養(yǎng)基中:氨芐青霉素,50μg/mL;卡那霉素,20μg/mL;氯霉素,3μg/mL.(ⅱ)耐輻射奇球菌radA突變體的構(gòu)建.耐輻射奇球菌radA基因的突變根據(jù)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行.利用引物(5′-GAGTTGTTGGAGGGCGAT-3′和5′-AA-CGGCTTTCACGGCTTCTT-3′)PCR擴(kuò)增含有radA基因的片段.將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體(TaKaRa,日本)上,獲得的質(zhì)粒在大腸桿菌DH5α菌株中擴(kuò)增.提取的質(zhì)粒鑒定后用BssHⅡ酶消化并連接到含抗卡那霉素抗性基因和groEL啟動(dòng)子的BssHⅡ片段上.將獲取的質(zhì)粒線性化并轉(zhuǎn)化到處于指數(shù)生長期的耐輻射奇球菌R1.在含20μg/mL卡那霉素的TGY固體培養(yǎng)基上初步篩選到具有卡那抗性的重組體,并通過PCR驗(yàn)證基因是否被破壞.得到的突變體命名為MR.(ⅲ)補(bǔ)償質(zhì)粒的構(gòu)建.首先用引物5′-GG-AATTCCATATGGAGCGGGTGGCGG-3′和5′-CGCG-GATCCTCAGCGCCAAACGGCTTTC-3′從耐輻射奇球菌基因組中擴(kuò)增radA基因序列.PCR產(chǎn)物測序結(jié)果表明無任何突變引入.用NdeⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物酶切并克隆到預(yù)先用相同酶消化過的pRADK載體上,獲得質(zhì)粒pRADKradA-D.補(bǔ)償質(zhì)粒pRADKradA-E(表達(dá)大腸桿菌RadA蛋白)通過與pRADKradA-D相似的方法構(gòu)建,所用引物為:5′-GGAATTCCATATGGTGGCAAAAGCTCCAAAAC-3′和5′-CGCGGATCCTTATAAGTCGTCGAACACGCTA-AG-3′.為了深入研究耐輻射奇球菌RadA蛋白的功能,我們同時(shí)也建立了其他3個(gè)補(bǔ)償質(zhì)粒,分別用于表達(dá)3種不同的被截?cái)嗔说哪洼椛淦媲蚓鶵adA蛋白(圖1).以上這些質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌radA突變體中,用于下一步的實(shí)驗(yàn).(ⅳ)γ射線和紫外線輻射以及過氧化氫處理下細(xì)胞存活率分析.耐輻射奇球菌培養(yǎng)到A600值為0.8后,將其懸浮在磷酸緩沖液中,在室溫下用不同劑量的γ射線處理.輻射結(jié)束后,稀釋到一定的濃度均勻涂布于TGY固體培養(yǎng)上.在紫外線輻照處理過程中將處于指數(shù)期的細(xì)胞用磷酸緩沖液連續(xù)稀釋后均勻涂布于TGY固體培養(yǎng)上,然后將菌體在不同的紫外線輻射劑量下進(jìn)行照射.過氧化氫處理對于細(xì)胞生存率的影響按文獻(xiàn)中提到的方法測定:指數(shù)生長期細(xì)胞用不同濃度的過氧化氫4℃處理30min,然后稀釋到適宜的濃度并涂布到TGY固體培養(yǎng)基.以上3種處理均需孵育3d后進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù).2實(shí)驗(yàn)與分析2.1耐輻射奇大腸桿菌rada蛋白與大腸桿菌rada蛋白的比較用耐輻射奇球菌RadA作為種子,PSI-BLAST搜索結(jié)果表明,耐輻射奇球菌RadA蛋白的RecA類似結(jié)構(gòu)域和細(xì)菌中的RadA蛋白有更高的相似性(表2)耐輻射奇球菌RadA蛋白與大腸桿菌RadA有47%的同源性和61%的相似性;而且很多關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)在兩者之間高度保守(圖2(b)).ClustalW比對結(jié)果顯示,鋅指結(jié)構(gòu)基序,負(fù)責(zé)ATP結(jié)合的walkerboxA和walkerboxB,保守序列KNRFG在耐輻射奇球菌和大腸桿菌中均存在(圖2(a)).和大腸桿菌RadA蛋白一樣,耐輻射奇球菌RadA也由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成,即N端鋅指結(jié)構(gòu)域,RecA類似結(jié)構(gòu)域和C端Lon蛋白酶結(jié)構(gòu)域(圖1).2.2rada基因突變利用反向插入突變方法我們成功構(gòu)建了耐輻射奇球菌radA突變體.PCR鑒定結(jié)果顯示,突變體MR中的PCR片段長度是2560bp,而野生型R1中的PCR片段長度是1512bp,這和預(yù)期結(jié)果一致(圖3).radA基因突變導(dǎo)致耐輻射奇球菌對γ射線和紫外線輻照的敏感性輕度增加,然而對于過氧化氫氧化脅迫的抗性沒有影響(圖4).2.3耐輻射奇球形rada對射線和紫外線輻照的抗性和耐輻射奇球形rada的抗性作用為了研究大腸桿菌和耐輻射奇球菌RadA蛋白是否具有相似的功能,我們構(gòu)建了2個(gè)補(bǔ)償質(zhì)粒,一個(gè)表達(dá)大腸桿菌RadA蛋白,另一個(gè)表達(dá)耐輻射奇球菌RadA蛋白.將它們分別轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌radA突變體中.結(jié)果表明,耐輻射奇球菌RadA可以完全補(bǔ)償耐輻射奇球菌radA突變體對γ射線和紫外線輻照的抗性,這也進(jìn)一步驗(yàn)證了耐輻射奇球菌radA突變體對γ射線和紫外線抗性的降低是由于耐輻射奇球菌radA基因的突變而不是其他因素造成的.進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示,大腸桿菌RadA也可以完全補(bǔ)償耐輻射奇球菌radA突變體對γ射線和紫外線輻照的抗性(圖5).以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在DNA損傷修復(fù)方面,耐輻射奇球菌RadA與大腸桿菌RadA可能行使相似的功能.2.4lon信號(hào)域?qū)δ洼椛淦媲蛐蝦ada突變體的抗性為了深入研究耐輻射奇球菌RadA蛋白不同結(jié)構(gòu)域可能的生物學(xué)功能,我們構(gòu)建了3個(gè)補(bǔ)償質(zhì)粒分別表達(dá)不同的被截?cái)嗔说哪洼椛淦媲蚓鶵adA蛋白(圖1).鋅指結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致耐輻射奇球菌比radA突變體對γ射線和紫外線輻照的抗性更低;單獨(dú)缺失Lon蛋白酶結(jié)構(gòu)域卻能使耐輻射奇球菌比radA突變體對γ射線和紫外線輻照的抗性略有增加;RecA類似結(jié)構(gòu)域補(bǔ)償耐輻射奇球菌radA突變體的表型與耐輻射奇球菌radA突變體的表型完全一致(圖5).這些結(jié)果表明,耐輻射奇球菌RadA蛋白3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域參與DNA損傷修復(fù)過程并行使不同的功能.3rada蛋白功能分析在很多生物體中,RecA/RadA/Rad51蛋白超家族在同源重組和DNA損傷修復(fù)過程中都扮演了十分重要的角色.研究發(fā)現(xiàn),與古細(xì)菌和真核生物RadA相比,耐輻射奇球菌的RadA蛋白與細(xì)菌的RadA蛋白更為相似,這表明耐輻射奇球菌的RadA蛋白與細(xì)菌的蛋白具有相似的功能.在耐輻射奇球菌中,γ射線會(huì)導(dǎo)致數(shù)百個(gè)DNA雙鏈斷裂以及上千個(gè)DNA單鏈損傷,并伴有大量自由基的產(chǎn)生.這些DNA損傷對于細(xì)胞的生存是致命的,但可以通過各種DNA損傷修復(fù)途徑進(jìn)行修復(fù).耐輻射奇球菌中radA基因的敲除一定程度上降低了該菌對γ射線和紫外線的輻射抗性,這表明RadA蛋白參與了這些修復(fù)過程.大腸桿菌的RadA蛋白參與了復(fù)制叉遷移過程而且這個(gè)功能可以由RecG和RuvABC替代.我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的RadA蛋白可以完全補(bǔ)償耐輻射奇球菌radA突變體對γ射線和紫外線輻照的抗性.這也表明,在DNA損傷修復(fù)方面,耐輻射奇球菌的RadA蛋白可能與大腸桿菌RadA蛋白有相同的功能,也參與了復(fù)制叉遷移過程.不同RadA蛋白結(jié)構(gòu)域?qū)δ洼椛淦媲蚓鷕adA突變體的補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)表明,耐輻射奇球菌RadA蛋白的不同結(jié)構(gòu)域具有不同的功能.與突變體的表型相比較當(dāng)用缺失N端鋅指結(jié)構(gòu)域的耐輻射奇球菌RadA補(bǔ)償時(shí),補(bǔ)償菌株對γ射線和紫外線輻照處理更加敏感相反,用缺少Lon蛋白酶結(jié)構(gòu)域的耐輻射奇球菌RadA補(bǔ)償時(shí),補(bǔ)償菌株對γ射線和紫外線輻射的抗性略微增強(qiáng).這些結(jié)果表明,鋅指結(jié)構(gòu)域可能負(fù)責(zé)促進(jìn)DNA和RadA蛋白的結(jié)合并保護(hù)DNA受到更嚴(yán)重的損傷.而Lon蛋白酶結(jié)構(gòu)域則可以分解那些參與DNA修復(fù)損傷途經(jīng)的蛋白并導(dǎo)致抗性進(jìn)一步降低RecA類似結(jié)構(gòu)域不能單獨(dú)行