ni2+沖擊及恢復(fù)性馴化對(duì)厭氧顆粒污泥中古細(xì)菌種群多樣性的影響

作為金屬酶的一個(gè)重要激酶或它的基本結(jié)合，金屬離子在生物生活活動(dòng)中起著重要作用。ni2+對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)并不需要。然而，近年來(lái)對(duì)裝甲細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)需求的研究表明，ni2+不僅是組成硝基細(xì)菌氮和co脫氫酶的重要活性基團(tuán)，也是重要的細(xì)菌毒素活性物質(zhì)。作為裝甲細(xì)菌生長(zhǎng)所需的微金屬養(yǎng)分，它激活了裝甲細(xì)菌的代謝過(guò)程，對(duì)厭氧污泥的活性起到了一定的提高，促進(jìn)了厭氧發(fā)酵過(guò)程。尤其是對(duì)于甲蟲(chóng)菌的ph30，ni2+具有其他微金屬元素?zé)o法替代的效果，過(guò)量ni2+會(huì)抑制生物活性?？紤]到古代細(xì)菌在厭氧消化過(guò)程中的重要作用，研究了ni2+對(duì)厭氧污泥中的古細(xì)菌影響機(jī)制，對(duì)提高厭氧處理系統(tǒng)中的有機(jī)物分解效率具有重要意義。筆者通過(guò)向2-CP馴化后的厭氧顆粒污泥中投加高濃度的Ni2+,從Ni2+沖擊前后及恢復(fù)性馴化10d后的厭氧顆粒污泥中直接提取總DNA,用古細(xì)菌特異性引物ARC21F/ARC958R進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及序列分析等,以考察Ni2+沖擊前后及恢復(fù)性馴化后降解2-CP厭氧顆粒污泥古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的變化,以期在分子生物學(xué)水平上闡明Ni2+對(duì)降解2-CP厭氧顆粒污泥的古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響,為提高有機(jī)物的厭氧降解效率提供一定的理論依據(jù).1材料和方法1.1小反應(yīng)器ni2+沖擊后試驗(yàn)裝置為升流式厭氧反應(yīng)器,有大小2種尺寸.大反應(yīng)器用于污泥馴化,內(nèi)徑150mm,外徑250mm,高1000mm,有效體積13L.小反應(yīng)器用于Ni2+沖擊及沖擊后污泥的恢復(fù)性馴化,內(nèi)徑50mm,外徑80mm,高400mm,有效容積0.75L.1.2預(yù)處理及光譜測(cè)試接種污泥中w(Ni)為0.2μg/g.2-CP厭氧降解污泥在大反應(yīng)器中用葡萄糖和2-CP共同馴化,并加入所需的營(yíng)養(yǎng)元素液:MgSO485.2mg/L,K2HPO450.0mg/L,Ca(HCO3)223.2mg/L,KH2PO420.0mg/L,NiSO48.4mg/L,FeSO46.8mg/L,NaHCO31220mg/L,NH4HCO3780mg/L.進(jìn)水CODCr控制在2000mg/L左右,溫度為(37±1)℃.馴化后的污泥對(duì)25mg/L的2-CP的去除率大于95%,且效果穩(wěn)定.將2-CP馴化成功的顆粒污泥清洗過(guò)篩后裝入小反應(yīng)器中進(jìn)行Ni2+的沖擊試驗(yàn).進(jìn)水為300mg/L的Ni2+和25mg/L的2-CP及相應(yīng)配比的營(yíng)養(yǎng)液(鎳鹽除外),水力停留時(shí)間為12h,連續(xù)沖擊3d.沖擊之后,系統(tǒng)進(jìn)水基質(zhì)與馴化期間進(jìn)水基質(zhì)相同,以考察Ni2+沖擊后厭氧系統(tǒng)對(duì)2-CP的降解能力及恢復(fù)狀況.2-CP的測(cè)定用HPLC法,污泥中w(Ni)在微波消解后用等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)試.ICP光譜儀(Optima2100DV,美國(guó)PerkinElmer公司),檢測(cè)器為全譜直讀光譜檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為231.6nm,溫度為6000～8000K.1.3總dna的提取和nd-pcr檢測(cè)從2-CP馴化穩(wěn)定后(25mg/L)的大反應(yīng)器,300mg/L的Ni2+連續(xù)沖擊3d后及恢復(fù)性馴化10d后的小反應(yīng)柱中各取濕污泥約200mg,蒸餾水沖洗3遍,5000r/min離心2min,棄去上清液,用蛋白酶K,氯仿/異戊醇方法直接抽提污泥樣品的總DNA.提取的總DNA用100μL無(wú)菌超純水溶解,加入RNAase(質(zhì)量濃度100μg/mL),37℃溫育30min.總DNA的片段大小和質(zhì)量用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳(DYB-I型電泳儀)檢驗(yàn),用紫外分光光度計(jì)(BioPhotometor,Eppendorf公司)測(cè)定其質(zhì)量濃度為150μg/mL.1.41srdna.9和k-pcr擴(kuò)增為考察Ni2+沖擊對(duì)降解2-CP厭氧顆粒污泥古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響,用古細(xì)菌特異性引物ARC21F(5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′,E.Colinumbering2～21)-ARC958R(5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′,E.Colinumbering940～958)擴(kuò)增16SrDNA.引物由invitrogen生物技術(shù)有限公司合成.PCR反應(yīng)在MastercyclerGradient(Eppendorf公司)上進(jìn)行,50μL的PCR反應(yīng)體系為:10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL,10mmol/L的dNTP溶液1μL,10mmol/L引物對(duì)各1μL,Taq酶2個(gè)單位,樣品DNA溶液2μL,加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL.古細(xì)菌的PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min;94℃,45s;51℃,60s;72℃,90s,30個(gè)循環(huán);72℃,10min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后,割下目標(biāo)片段大小的條帶,用膠純化回收試劑盒進(jìn)行回收和純化(WizardSVGelandPCRClean-UPSystem,Promega公司),用紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化后的PCR產(chǎn)物濃度.1.5質(zhì)粒的鑒定與測(cè)序按操作說(shuō)明,將純化后的DNA片段克隆至pMD19-TVector(Takara公司)上,取適量轉(zhuǎn)化菌液涂布在選擇性LB瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜(18h)以篩選含重組質(zhì)粒的白色克隆子.為進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的白色克隆子是否為陽(yáng)性,挑取白色菌斑94℃煮沸2min以獲得質(zhì)粒DNA,按照1.4節(jié)中的條件做PCR(25μL反應(yīng)體系),產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證.把經(jīng)二次PCR驗(yàn)證并確定含目標(biāo)DNA片段的白色克隆子接種于2mL的LB母液(含50μg/mL氨芐青霉素)中,180～220r/min搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(37℃,18h),培養(yǎng)后的菌液送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序.2結(jié)果與討論2.1ni2+沖擊后系統(tǒng)的2-cp經(jīng)過(guò)300mg/L的Ni2+沖擊3d后,跟蹤檢測(cè)反應(yīng)器出水中ρ(2-CP).前期的研究表明,Ni2+沖擊后系統(tǒng)出水的ρ(2-CP)上升到15～20mg/L,降解率低于60%.經(jīng)過(guò)15d的恢復(fù)性馴化,系統(tǒng)對(duì)2-CP的降解恢復(fù)較快,40d后才能完全恢復(fù)到?jīng)_擊前的狀態(tài).2.21pcr擴(kuò)增及測(cè)序提取的總DNA大小約為23kbp,用古細(xì)菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到大小約為930bp的DNA片段.純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆,均挑取45個(gè)克隆子用古細(xì)菌引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,經(jīng)鑒定分別有33,30和35個(gè)克隆子為陽(yáng)性,各取30個(gè)克隆子的菌液測(cè)序.2.3ni2-ii和恢復(fù)性繁殖對(duì)古細(xì)胞多樣性的影響2.3.1微生物物種的豐度變化對(duì)2-CP馴化穩(wěn)定后,Ni2+沖擊后及恢復(fù)性馴化10d后的厭氧污泥古細(xì)菌進(jìn)行序列分析的結(jié)果表明,Ni2+沖擊前后古細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化.沖擊前后厭氧顆粒污泥中存在23個(gè)共有的古細(xì)菌菌種(見(jiàn)圖1):Methanothrixsoehngenii,Methanosaetaconcilii,Unculturedeuryarchaeote及Unculturedarchaeon等,它們的豐度在Ni2+沖擊前后發(fā)生了較大變化.其中,Methanothrixsoehngenii和UnculturedarchaeonTA05在污泥微生物中的豐度均由Ni2+沖擊前的93.9%降為沖擊后的70.4%,UnculturedarchaeonTA04和UnculturedarchaeonTA01的豐度分別由沖擊前的90.9%和57.6%降為沖擊后的66.7%和48.1%.而UnculturedarchaeonTA02,UnculturedarchaeonArc.No.20,Methanobacteriumaarhusense,Methanobacteriumbeijingense等菌種的豐度在經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊后均有所提高.同時(shí)發(fā)現(xiàn),與沖擊前相比,經(jīng)Ni2+沖擊后的厭氧污泥中古細(xì)菌類(lèi)型更為豐富,新出現(xiàn)了8個(gè)古細(xì)菌菌種(見(jiàn)圖1),如MethanobacteriumformicicumstrainS1,Toluene-degradingMethanogenicconsortiumarchaeonM1,CandidatusMethanoregulabooneistrain6A8等.這說(shuō)明300mg/L的Ni2+沖擊對(duì)厭氧系統(tǒng)的影響較大,造成系統(tǒng)中主要古細(xì)菌菌種豐度的降低,部分古細(xì)菌菌種的豐度有所提高,同時(shí)厭氧系統(tǒng)能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生一些新的古細(xì)菌菌種以適應(yīng)環(huán)境的突然變化.2.3.2methnobacteritye菌的生長(zhǎng)把Ni2+剛沖擊后與經(jīng)過(guò)10d恢復(fù)性馴化后的污泥樣品進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn),它們存在19個(gè)共有的古細(xì)菌菌種(見(jiàn)圖2).經(jīng)過(guò)10d的恢復(fù)性馴化后,厭氧污泥中主要的古細(xì)菌菌種的豐度發(fā)生了輕微變化:Methanothrixsoehngenii和UnculturedarchaeonTA05在污泥微生物中的豐度均由Ni2+剛沖擊后的70.4%回升為72.4%,UnculturedarchaeonTA04和UnculturedarchaeonTA01的豐度分別由剛沖擊后的66.7%和48.1%提高到了72.4%和69%.Methanobacteriumaarhusense,Methanobacteriumcurvum,Methanobacteriumbeijingense等菌種的豐度有所降低,均由14.8%降到了6.9%.與Ni2+剛沖擊后相比,經(jīng)過(guò)10d恢復(fù)性馴化后的厭氧污泥中新出現(xiàn)了17個(gè)古細(xì)菌菌種(見(jiàn)表1):MethanobacteriumalcaliphilumstrainDSM3387,Methanobacteriumsp.M2及Methanobacteriumsubterraneum等,而Ni2+剛沖擊后的厭氧污泥中有12個(gè)古細(xì)菌菌種Toluene-degradingMethanogenicconsortiumarchaeonM1,CandidatusMethanoregulabooneistrain6A8及MethanogenicarchaeonNOBI-1等在經(jīng)過(guò)10d的恢復(fù)性馴化后發(fā)生了消亡.這說(shuō)明在Ni2+沖擊后的恢復(fù)性馴化過(guò)程中,厭氧系統(tǒng)能重新調(diào)整古細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)以降低其沖擊對(duì)體系造成的不利影響.由于沖擊的Ni2+含量過(guò)高,仍然有部分古細(xì)菌經(jīng)過(guò)恢復(fù)性馴化后也難以恢復(fù);同時(shí),部分對(duì)環(huán)境的變化適應(yīng)能力強(qiáng)的古細(xì)菌則在新環(huán)境中出現(xiàn).2.3.3其它古細(xì)菌種的增殖和降解直接比較Ni2+沖擊前和恢復(fù)性馴化10d后厭氧污泥古細(xì)菌的種群分布可以發(fā)現(xiàn),高濃度Ni2+的沖擊使得厭氧顆粒污泥中古細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化.如圖3所示,Methanothrixsoehngenii,UnculturedarchaeonTA05,UnculturedarchaeonTA04和UnculturedarchaeonTA01及UnculturedeuryarchaeoteEHB109等幾種主要的古細(xì)菌菌種的豐度經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊后大幅度降低,經(jīng)過(guò)10d的恢復(fù)性馴化后又略有回升;而其他部分菌種的豐度經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊后反而有所提高.厭氧污泥經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊并恢復(fù)性馴化了10d后,檢出的古細(xì)菌菌種由Ni2+沖擊前的23個(gè)增加到36個(gè),新增加了20個(gè)古細(xì)菌菌種(見(jiàn)圖4).而Ni2+沖擊前的污泥中原有的23個(gè)古細(xì)菌菌種減至16個(gè),有7個(gè)古細(xì)菌菌種UnculturedarchaeonTA02,UnculturedarchaeonWCHD3-07,MethanogenicarchaeonNOBI-1等經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊及恢復(fù)性馴化后發(fā)生消亡.說(shuō)明高濃度Ni2+的沖擊在短期內(nèi)造成厭氧系統(tǒng)中主要古細(xì)菌菌種豐度的降低,并改變了古細(xì)菌種群的分布結(jié)構(gòu),能適應(yīng)新環(huán)境的古細(xì)菌得到加強(qiáng),不能適應(yīng)的種群被削弱甚至消亡,同時(shí)產(chǎn)生了新的古細(xì)菌菌種,使得古細(xì)菌種群的分布更為豐富,以適應(yīng)新的厭氧體系.經(jīng)過(guò)恢復(fù)性馴化后,污泥微生態(tài)系統(tǒng)能較快地對(duì)環(huán)境條件的變化做出反應(yīng),逐步恢復(fù)系統(tǒng)中微生物的數(shù)量和活性,增強(qiáng)優(yōu)勢(shì)菌群,從而恢復(fù)對(duì)2-CP的降解能力.Baath等研究發(fā)現(xiàn),受鎳污染的土壤中總菌群的種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、群落多樣性減少,這與前期研究的結(jié)論一致:高濃度Ni2+的投加導(dǎo)致降解2-CP的厭氧體系中總菌群群落多樣性的減少.Takashima等發(fā)現(xiàn),將微量FeCl2,NiCl2和CoCl2直接投入廢水厭氧處理反應(yīng)器后,反應(yīng)器內(nèi)甲烷菌的優(yōu)勢(shì)菌種從Methanothrix變?yōu)镸ethanosarcina.筆者研究發(fā)現(xiàn),高濃度Ni2+的沖擊確實(shí)改變了厭氧系統(tǒng)中古細(xì)菌的種群分布結(jié)構(gòu),卻并未改變Methanothrix作為優(yōu)勢(shì)菌的地位,Methanothrixsoehngenii,UnculturedarchaeonTA05及UnculturedarchaeonTA04等古細(xì)菌的豐度雖然有所降低卻依然保持優(yōu)勢(shì)菌的地位.Capone等研究發(fā)現(xiàn),1000mg/kg干土中的Ni2+在短期對(duì)沼澤沉積層中微生物的產(chǎn)甲烷活性產(chǎn)生抑制后,反而會(huì)刺激微生物的活性;同樣,Ni2+在短期內(nèi)抑制硫酸還原反應(yīng),長(zhǎng)期卻沒(méi)有抑制,可能是沉淀、絡(luò)合、甲基化作用以及其他生物體(如硫酸還原菌)的競(jìng)爭(zhēng)作用導(dǎo)致對(duì)產(chǎn)甲烷菌活性抑制的減弱.可以認(rèn)為,正是因?yàn)镹i2+作為甲烷菌生長(zhǎng)必需的微量金屬元素對(duì)甲烷菌活性產(chǎn)生的特有激活作用,才使得2-CP厭氧降解系統(tǒng)經(jīng)過(guò)Ni2+沖擊及恢復(fù)性馴化后,在總菌群的種群多樣性減少的情況下,古細(xì)菌種群多樣性卻顯著增加,且厭氧系統(tǒng)能較快恢復(fù)對(duì)2-CP的降解能力,也說(shuō)明了古細(xì)菌是保障整個(gè)厭氧降解體系能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的主要功能菌群.3微生物群落變化a.高濃