PAGE5高效液相色譜實(shí)驗(yàn)高乃群實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?進(jìn)一步理解高效液相色譜的基本原理；2熟悉高效液相色譜儀器的構(gòu)成；3了解影響高效液相色譜分離的主要操作參數(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：基本原理

在互不相溶的兩相——流動(dòng)相和固定相的體系中，當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，第三組分（即溶質(zhì)或吸附質(zhì)）連續(xù)不斷地在兩相之間進(jìn)行分配，這種分配過程即為色譜過程。由于流動(dòng)相、固定相以及溶質(zhì)混合物性質(zhì)的不同，在色譜過程中溶質(zhì)混合物中的各組分表現(xiàn)出不同的色譜行為，從而使各組分彼此相互分離，這就是色譜分析法的實(shí)質(zhì)。也就是說，當(dāng)一種不與被分析物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的被稱為載氣的永久性氣體（例如H2、N2、He、Ar、CO2等）攜帶樣品中各組分通過裝有固定相的色譜柱時(shí)，由于試樣分子與固定相分子間發(fā)生吸附、溶解、結(jié)合或離子交換，使試樣分子隨載氣在兩相之間反復(fù)多次分配，使那些分配系數(shù)只有微小差別的組分發(fā)生很大的分離效果，從而使不同組分得到完全分離，例如一個(gè)試樣中含A、B二個(gè)組分，已知B組分在固定相中的分配系數(shù)大于A，即KB>KA，如圖1-1所示。

當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱時(shí)，組分A、B以一條混合譜帶出現(xiàn)，由于組分B在固定相中的溶解能力比A大，因此組分A的移動(dòng)速度大于B，經(jīng)過多次反復(fù)分配后，分配系數(shù)較小的組分A首先被帶出色譜柱，而分配系數(shù)較大的組分B則遲被帶出色譜柱，于是樣品中各組分達(dá)到分離的目的。設(shè)法將流出色譜柱某組分的濃度變化用電壓、電流信號(hào)記錄下來，便可逐一進(jìn)行定性和定量分析。2.高效液相色譜法的分類及其分離原理液-固色譜法液—液色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法a.液-固色譜法（液-固吸附色譜法）

固定相是固體吸附劑，它是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來進(jìn)行分配的。液-固色譜法的作用機(jī)制吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，其表面常存在分散的吸附中心點(diǎn)。流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子X(液相)被流動(dòng)相S帶入色譜柱后，在隨載液流動(dòng)的過程中，發(fā)生如下交換反應(yīng)：X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相)其作用機(jī)制是溶質(zhì)分子X(液相)和溶劑分子S(液相)對(duì)吸附劑活性表面的競爭吸附。吸附反應(yīng)的平衡常數(shù)K為：K值較小：溶劑分子吸附力很強(qiáng)，被吸附的溶質(zhì)分子很少，先流出色譜柱。K值較大：表示該組分分子的吸附能力較強(qiáng)，后流出色譜柱。發(fā)生在吸附劑表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色譜分離的基礎(chǔ)。

②液-固色譜法的吸附劑和流動(dòng)相

常用的液-固色譜吸附劑：薄膜型硅膠、全多孔型硅膠、薄膜型氧化鋁、全多孔型氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。

一般規(guī)律：對(duì)于固定相而言，非極性分子與極性吸附劑(如硅膠、氧化銅)之間的作用力很弱，分配比k較小，保留時(shí)間較短；但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強(qiáng)，分配比k大，保留時(shí)間長。對(duì)流動(dòng)相的基本要求：試樣要能夠溶于流動(dòng)相中流動(dòng)相粘度較小流動(dòng)相不能影響試樣的檢測(cè)常用的流動(dòng)相：甲醇、乙腈、水等。b.液-液色譜法（液-液分配色譜法）

將液體固定液涂漬在擔(dān)體上作為固定相①液-液色譜法的作用機(jī)制

溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時(shí)，在固定液中溶解度較小的組分較難進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定液中溶解度較大的組分容易進(jìn)入固定液，在色譜柱中向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。液-液色譜法與液-液萃取法的基本原理相同，均服從分配定律：K=C固/C液K值大的組分，保留時(shí)間長，后流出色譜柱。②正相色譜和反相色譜正相分配色譜用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動(dòng)相；反相分配色譜用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動(dòng)相一般地，正相色譜是固定液的極性大于流動(dòng)相的極性，而反相色譜是固定相的極性小于流動(dòng)相的極性。正相色譜適宜于分離極性化合物，反相色譜則適宜于分離非極性或弱極性化合物。③液-液色譜法的固定相常用的固定液為有機(jī)液體，如極性的β，β′氧二丙腈(ODPN)，非極性的十八烷(ODS)和異二十烷(SQ)等。①凝膠色譜法的作用機(jī)制：體積大于凝膠孔隙的分子，由于不能進(jìn)入孔隙而被排阻，直接從表面流過，先流出色譜柱；小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來隨載液流動(dòng)，后流出色譜柱；中等體積的分子可以滲入較大的孔隙中，但受到較小孔隙的排阻，介乎上述兩種情況之間。凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行分離的一種色譜分析方法。②凝膠色譜法的固定相：軟質(zhì)凝膠、半硬質(zhì)凝膠和硬質(zhì)凝膠三種。實(shí)驗(yàn)設(shè)備：高效液相色譜儀儀器及試劑：鄰硝基苯酚間苯三酚注射器實(shí)驗(yàn)步驟及數(shù)據(jù)處理