CFX96實時熒光定量PCR儀操作流程及注意事項開始運行儀器打開電腦打開定量PCR儀底座開關(guān)啟動CFXManager軟件

放置樣品將PCR反應體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學級封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應管表面。將反應管按順序放入儀器的加熱孔中。

設置程序，運行實驗定量PCR軟件操作基本步驟為：a.設置熱循環(huán)程序文件（ProtocolTab）

“StartRun”鍵，運行程序熱循環(huán)程序文件（ProtocolTab）設置指南：點擊Edit（編輯）或CreateNew（創(chuàng)建新程序）。反應板設置文件（PlateTab）設置指南：選擇本次實驗所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應孔第一熒光染料對應的樣品類型為標準品（Standard），點擊“DilutionSeries”鍵可設置其標準品濃度及稀釋倍數(shù)。點擊“StartRun”鍵。單擊openlid（打開熱蓋）或Closelid（關(guān)閉熱蓋）放置樣品；單擊StartRun，保存文件，開始運行程序。

結(jié)果分析PCR反應結(jié)束后，軟件會自動計算標準曲線和Ct值等。如需進行表達量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應分析功能。點擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報告單

關(guān)閉運行儀器實驗結(jié)束后取出反應管，順序關(guān)閉CFXManager軟件、定量PCR儀電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀器上蓋部分為全自動控制，在通電狀態(tài)，嚴禁任何人為干涉上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會導致上蓋故障，危及儀器使用。

CFXManager軟件操作快速指南實驗操作程序設置圖1顯示實驗設置窗口中一個預覽的程序。點擊

CreateNew，打開程序編輯器創(chuàng)建一個新的程序。點擊

SelectExisting，通過瀏覽器加載一個程序或?qū)ζ溥M行編輯。使用ExpressLoad下拉菜單直接加載一個程序或?qū)ζ溥M行編輯。點擊

EditSelected，打開程序編輯器編輯所選程序的各個步驟。點擊

StartRun開始運行當前加載的程序。程序編輯器程序編輯器可用來創(chuàng)建一個新程序或編輯一個已存在的程序，圖2。

1．在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會用藍色高亮顯示），點擊溫度或保持時間進行直接編輯。2．點擊

InsertStep在程序中增加一個溫度步驟。點擊

DeleteStep在程序中刪除選中的步驟。3．點擊

AddPlateReadtoStep，在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時間。如果當前的高亮顯示步驟已經(jīng)進行了讀板設置，則這一選項變?yōu)镽emovePlateRead。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點擊

RemovePlateRead。4．點擊GOTO步驟的重復次數(shù)，改變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖2第4步。點擊GOTO步驟數(shù)可改變GOTO循環(huán)中所包含的步驟。增加一個梯度步驟：1．在程序編輯控制窗口中，點擊

InsertGradient，圖2。2．對梯度中最低和最高溫度值進行編輯，在圖形模式，文本模式下或出現(xiàn)在文本模式右側(cè)的梯度范圍計算器中直接點擊數(shù)值進行編輯，圖3。

3．在梯度范圍計算器中，對任何一行都可以賦予一個指定的溫度。每行的溫度都會調(diào)整為合適的溫度來滿足指定的溫度范圍。增加熔解曲線：1．在程序編輯控制窗口中，點擊

InsertMeltCurve，圖2。2．在圖形或文本顯示模式下，點擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖4第5步。3．點擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間。4．點擊保持時間編輯每一個增量溫度的保持時間。

CFXManager軟件數(shù)據(jù)分析快速指南

定量分析數(shù)據(jù)瀏覽擴增圖表可以顯示實驗中每個循環(huán)每個孔收集的相對熒光信號曲線。點擊位于擴增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖1。在孔選擇器中點擊孔，行或列來顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖1。選中的孔是藍色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標置于熒光信號曲線上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電子表格的孔上，或者標準曲線上均可以顯示出相應的信息。數(shù)據(jù)分析選項CFXManager軟件可以自動的扣除從各個孔所得數(shù)據(jù)的基線。從菜單欄中選擇

Settings，選擇BaselineThreshold可以改變基線范圍。軟件會自動計算基線的位置?？梢渣c擊并拖動閥值線來手動定位。點擊工具欄中View/EditPlate按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時創(chuàng)建新的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。圖表選項可用鼠標右鍵點擊任何圖表來復制或保存圖像，或選擇

ChartOptions來改變軸范圍或刪除柵格，圖2。點擊工具欄中

TraceStyles按鈕，或鼠標右鍵點擊任何圖表來設定制定孔的熒光信號曲線顏色。鼠標左鍵點擊任何圖表，向下和拖動光標可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中SelectWellGroup下拉菜單來瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖3。軟件可以針對每個分群作為獨立的實驗來處理，每一個分群可針對自己的設置進行分析，如進行自身標準曲線的分析。定量數(shù)據(jù)分析顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口中

QuantitationData，瀏覽數(shù)據(jù)計算和統(tǒng)計，包括每個孔的閥值（CT）和平均值以及復制的標準偏差，圖4。點擊任一列的標題進行基于列的行分類。鼠標右鍵點擊電子表格并選擇

Sort可進行基于多個列的行分類。鼠標左鍵點擊任一列的標題并向左或向右拖動可以重新排列電子表格中列的順序。鼠標右鍵點擊電子表格，選擇數(shù)據(jù)輸出格式如text，XML或Excel輸出數(shù)據(jù)，圖4。從

QuantitationData下拉菜單中選擇

Plate，在反應板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報告顯示選項點擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中

Report按鈕，圖1，打開Report窗口，圖5。點擊報告選項列表中的檢查窗，使制定信息包含在報告中，這些信息在預覽部分中會有所顯示，圖5。點擊工具欄中

File并選擇

Save，以PDF格式保存報告，或選擇Print打印報告。也可以保存報告為其它的文件格式。CFXManager軟件基因表達分析快速指南

通過嚴謹?shù)馁|(zhì)量控制，您可以使用GeneExpressionModuleofCFXManager軟件來評估樣品之間靶標濃度的相對差異。這種應用最常用的使用是評估cDNA樣品中靶標的濃度來推斷其mRNA水平。通常，一個或多個參照基因的含量被用來衡量目標基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品取樣的差異。通過生物學條件的研究，參照基因的表達水平通常不發(fā)生變化?；虮磉_分析設置圖1顯示各樣品孔含單一的熒光，四個復制類群，包含兩個不同靶標名稱和兩個不同的樣品名稱。指定參照基因1．點擊反應板編輯器中

ExperimentSettings或GeneExpressionModule，打開實驗設置窗口，圖2。

2．選擇

Targets。3．點擊合適的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標。4．點擊

ShowAnalysisSettings檢查窗，為靶標設置反應擴增效率。5．AutoEfficiency檢查窗被默認設定。如果實驗中運行一個標準曲線，從標準曲線中計算得到的擴增效率將在計算中被使用?；蛘邔线m的靶標輸入指定反應擴增效率值，則計算中將使用這一擴增效率值。指定對照樣本1．在

ExperimentSettings窗口，選擇

Samples標簽。2．點擊合適的檢查窗，選擇在計算中將被作為對照的樣本，圖3。對每個基因來說，對照樣本的值被指定為1，同時所有其他樣本相對于對照樣本的值會被顯示出來.

基因表達分析選擇分析模式1．從Mode下拉菜單中選擇分析模式，圖4：

a.NormalizedExpression⊿⊿C（t）-靶標基因的相對量可通過樣本的參照基因來進行相對量的衡量。⊿C（t）-靶標基因的相對量不能被衡量；結(jié)果顯示的是實驗中靶標基因相對于其他樣品的基因濃度。

圖形選項1

GraphData下拉菜單中選擇對照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，GraphData選項默認是對照相關(guān)。2

X軸下拉菜單中選擇X軸以Sample顯示或Target顯示。3

Y軸下拉菜單中選擇Linear，Log2或Log10作為Y軸刻度。4

ScalingOption下拉菜單中選擇Highest，Lowest或Unscaled。5

ErrorType下拉菜單中選擇StandardErrorofthe