./PRUE-LAMP檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌在中國(guó)區(qū)縣實(shí)驗(yàn)室診斷性能評(píng)估XichaoOu1.,QiangLi1.,HuiXia1.,YuPang1,ShengfenWang1,BingZhao1,YuanyuanSong1,YangZhou1,YangZheng1,ZhijianZhang5,ZhiyingZhang2,JunchenLi2,HaiyanDong2,JackZhang2,KaiManKam3,JunyingChi4,ShitongHuan4,DanielP.Chin4*,YanlinZhao1*摘要：背景：能夠在早期有效的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,尤其是涂布陰性的結(jié)核病,對(duì)全球肺結(jié)核防控至關(guān)重要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法與快速DNA提取法〔PURE-LAMP相結(jié)合,可以高靈敏性、高特異性、快速檢測(cè)痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌。盡管如此,PURE-LAMP尚缺乏足夠的評(píng)估,尤其是在資源有限的基層實(shí)驗(yàn)室。本研究中,通過(guò)對(duì)來(lái)自中國(guó)兩個(gè)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室肺結(jié)核疑似患者進(jìn)行檢測(cè),評(píng)估了PURE-LAMP法在基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的性能。方法與結(jié)果：自20XX4月-20XX2月,收集來(lái)自中國(guó)兩個(gè)縣級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的肺結(jié)核疑似患者三種痰液標(biāo)本〔即時(shí)痰,晚間痰和晨痰用于檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)L-J培養(yǎng)法做對(duì)照,結(jié)果顯示,PURE-LAMP法檢測(cè)即時(shí)痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的靈敏度達(dá)到70.67%。同時(shí),PURE-LAMP法在基于涂片呈陽(yáng)性培養(yǎng)陽(yáng)性,涂片陰性培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本中靈敏度分別為92.12%和53.81%。PURE-LAMP法檢測(cè)即時(shí)痰結(jié)核分枝桿菌中的特異性為98.32%?；谌N樣本檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,PURE-LAMP法的靈敏度和特異性分別為88.80%和96.86%。與固體培養(yǎng)法相比,PURE-ALMP法可顯著降低污染率。結(jié)論和意義：結(jié)果表明,在中國(guó)的基層結(jié)核病防治實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌,PURE-LAMP法具有較高的靈敏度和特異性。其具有高效、快速和安全的優(yōu)點(diǎn),值得在基層及偏遠(yuǎn)地區(qū)廣泛推廣使用。結(jié)核病仍然是威脅全世界健康的重大疾病,20XX,據(jù)統(tǒng)計(jì)新發(fā)結(jié)核病約860萬(wàn),死亡人數(shù)約130萬(wàn)[1]?？焖贉?zhǔn)確的診斷對(duì)結(jié)核病有效治療和防控至關(guān)重要[2-3]。目前,全世界圍結(jié)核病常用的診斷方法是涂片鏡檢,眾所周知該方法靈敏度低,特別是對(duì)感染HIV的低免疫力病人[4-5]。培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),靈敏度較涂片法高,但培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)〔2周-8周。為了滿足結(jié)核病防治快速靈敏的要求,一系列核酸擴(kuò)增方法不斷涌現(xiàn)[6-8]；然而,由于分子檢測(cè)需要復(fù)雜的操作流程和昂貴的儀器,設(shè)施簡(jiǎn)陋、技能缺乏的廣大基層實(shí)驗(yàn)室尚不能滿足這些條件來(lái)開(kāi)展。LAMP法是一種嶄新的恒溫核酸擴(kuò)增方法[12],不需要昂貴的儀器設(shè)備。TB-LAMP是日本榮研公司基于LAMP技術(shù)開(kāi)發(fā)的結(jié)核菌檢測(cè)試劑盒。它具有的一系列特征為資源缺乏的基層實(shí)驗(yàn)室提供了分子檢測(cè)平臺(tái)：快速〔40mins,恒溫〔只需加熱快,穩(wěn)定〔對(duì)抑制劑和反應(yīng)條件具有一定的容忍性,檢測(cè)結(jié)果可以直接用肉眼觀察判定[13-15]。2007-20XX,榮研公司與FIND基金會(huì)合作,成功研發(fā)出新一代TB-LAMP檢測(cè)試劑盒,即PRUE-LAMP,該試劑盒包括一個(gè)簡(jiǎn)單的DNA提取過(guò)程[16]。PRUE-LAMP具有更高的靈敏度和特異性,并重新設(shè)計(jì)優(yōu)化了反應(yīng)引物。DNA的提取和擴(kuò)增過(guò)程都可以在一個(gè)封閉的反應(yīng)管中進(jìn)行,這樣可以有效減少污染風(fēng)險(xiǎn)。PRUE-LAMP包括3個(gè)步驟：樣本準(zhǔn)備〔10-20min,擴(kuò)增〔40min,直接通過(guò)肉眼觀察熒光檢測(cè)結(jié)果〔0.5-1min[17]。為了評(píng)估PURE-LAMP的臨床性能,我們選擇了中國(guó)省2個(gè)區(qū)縣級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。材料和方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)省兩個(gè)顯微鏡檢實(shí)驗(yàn)室〔獲嘉縣和市進(jìn)行。收集20XX4月-20XX2月來(lái)自門(mén)診就診的連續(xù)納入的肺結(jié)核疑似患者〔連續(xù)咳嗽咳痰2周,咳血,伴有血樣痰痰液標(biāo)本用于研究,每位患者采集3種痰液〔即時(shí)痰、晚間痰、晨痰,每份痰樣量至少2mL〔0.1mL用于涂片,1mL用于培養(yǎng),0.06mL用于PURE-LAMP實(shí)驗(yàn)。每份痰液樣本同時(shí)進(jìn)行直接涂片抗酸染色、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP實(shí)驗(yàn),中國(guó)國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室〔NTRL的實(shí)驗(yàn)員收集所有培養(yǎng)呈陽(yáng)性菌并進(jìn)行16S-23SrDNAITS測(cè)序分析來(lái)鑒別菌種。以固體培養(yǎng)為參照來(lái)評(píng)估PURE-LAMP性能。本實(shí)驗(yàn)之前,兩個(gè)鏡檢實(shí)驗(yàn)室均未做過(guò)固體培養(yǎng)和PCR實(shí)驗(yàn),為了確保LAMP檢測(cè)和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)質(zhì)量,所有實(shí)驗(yàn)員都在NTRL經(jīng)過(guò)1周的培訓(xùn)。為了確保固體培養(yǎng)質(zhì)量,和獲嘉的工作人員預(yù)先進(jìn)行了9個(gè)月的TB培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)。LAMP實(shí)驗(yàn)也在當(dāng)?shù)卦囼?yàn)點(diǎn)進(jìn)行了培訓(xùn)。方法葁-尼染色鏡檢和羅氏培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)員按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[18]的要求做好實(shí)驗(yàn)室涂片鏡檢的室和室間質(zhì)量控制。固體培養(yǎng)時(shí),痰液處理和接種方法參照WHO標(biāo)準(zhǔn)[19],37℃培養(yǎng)8周。PURE-LAMP：PURE-LAMP實(shí)驗(yàn)步驟參照[17],各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的操作人員均經(jīng)過(guò)廠商培訓(xùn)并通過(guò)每人3個(gè)流程的熟練測(cè)試,操作流程如下：采用榮研公司生產(chǎn)的痰液專(zhuān)用大孔吸液器吸取60uL痰液于含有提取液的加熱管中,混勻后90℃加熱5min。然后將加熱管和吸附試劑管組裝并充分混勻直至白色試劑完全溶解。然后組裝上滴注蓋,擠壓30uL樣本于反應(yīng)管中。蓋好反應(yīng)管蓋子與反應(yīng)試劑充分溶解后與67℃反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于熒光檢測(cè)裝置中判定并記錄結(jié)果。菌種鑒定：所有培養(yǎng)呈陽(yáng)性菌經(jīng)過(guò)16S-23SrDNAITS測(cè)序分析進(jìn)行種屬鑒定。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用TB-LAMP實(shí)驗(yàn)特異性,靈敏性,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值〔PPV,陰性預(yù)測(cè)值〔NPV來(lái)評(píng)估LAMP實(shí)驗(yàn)性能。以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS19.0數(shù)據(jù)分析軟件分析,P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果樣本來(lái)源自20XX4月-20XX2月共收集了初診可疑肺結(jié)核患者1378例,排除不合格的樣本,最終有1329例用于數(shù)據(jù)分析〔圖1。其中,888例是男性,441例是女性,53例年齡不到20歲,165<12.42%>例涂片和培養(yǎng)呈陽(yáng)性,210<15.80%>例涂片呈陰性培養(yǎng)呈陽(yáng)性,954<71.78%>培養(yǎng)呈陰性〔表1。PURE-LAMP檢測(cè)即時(shí)痰性能在1329例疑似患者中,PURE-LAMP檢測(cè)結(jié)核菌的靈敏度和特異性〔表2,圖1。以固體培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn),1203份〔90.52%與固體培養(yǎng)法一致,靈敏度為70.67%,對(duì)與涂片呈陽(yáng)培養(yǎng)呈陽(yáng)的樣本,PURE-LAMP的靈敏度是92.12%,對(duì)于涂片呈陰培養(yǎng)呈陽(yáng)的樣本,PURE-LAMP的靈敏度是53.81%,PURE-LAMP的特異性是98.32%。PURE-LAMP檢測(cè)不同時(shí)期痰標(biāo)本以及不同時(shí)期混合標(biāo)本性能分析了不同時(shí)期取得的痰液樣本〔即時(shí)痰,夜間痰,晨痰以及不同時(shí)期痰標(biāo)本混合〔即時(shí)痰+夜間痰,即時(shí)痰+晨痰,夜間痰+晨痰,即時(shí)痰+夜間痰+晨痰的靈敏度和特異性〔表3,結(jié)果表明三個(gè)時(shí)期混合標(biāo)本的特異性和靈敏度要高于單個(gè)時(shí)期取的痰液樣本。PURE-LAMP和培養(yǎng)法污染率用PURE-LAMP檢測(cè)475例新結(jié)核病疑似病人,只有一份樣本污染,總污染率是0.21%。4129份樣本取自2個(gè)治療室的1378例患者,每份樣本分別接種2管培養(yǎng),共培養(yǎng)8268份,其中276份污染,總污染率是3.3%。不同方法差異分析在培養(yǎng)呈陰性樣本中有30份樣本PURE-LAMP檢測(cè)呈陽(yáng),2份涂片呈陽(yáng)。在PURE-LAMP檢測(cè)呈陰性樣本中,有42份培養(yǎng)呈陽(yáng)性,其中,6份測(cè)序結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌,36份測(cè)序顯示為結(jié)核分枝桿菌,涂片呈陰性。26<72.22%>份培養(yǎng)菌落數(shù)<20。討論結(jié)核病的早期診斷對(duì)結(jié)核病的防治至關(guān)重要,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,一系列快速檢測(cè)和診斷TB的方法不斷涌現(xiàn)。LAMP技術(shù)是Notomi博士在20XX開(kāi)發(fā)出的一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)[12]。PURE-LAMP是一種新穎,簡(jiǎn)便,防污染的TB檢測(cè)試劑盒。本研究中,PURE-LAMP對(duì)涂片呈陰培養(yǎng)呈陽(yáng)的樣本靈敏度是53.81%,整體靈敏度為70.67%,特異性為98.32%,與其他研究結(jié)果一致[11]。與涂片鏡檢相比,靈敏度要高,結(jié)果表明PURE-LAMP可以用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。中國(guó)相關(guān)規(guī)定推薦采集結(jié)核病疑似患者3個(gè)時(shí)期樣本用于TB檢測(cè)[21],本實(shí)驗(yàn)中,我們?cè)u(píng)估了每種樣本對(duì)于結(jié)核病診斷的影響,PURE-LAMP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采集3個(gè)時(shí)期的痰液樣本用于檢測(cè)要比只采集即時(shí)痰意義更大?？紤]到成本因素,避免給患者造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),今后有必要評(píng)估PURE-LAMP法檢測(cè)不同時(shí)期樣本組合成本。本實(shí)驗(yàn)中PURE-LAMP的污染率是0.21%,2個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)操作都進(jìn)行了嚴(yán)格分區(qū),包括試劑存儲(chǔ)區(qū),前處理區(qū),擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。每個(gè)區(qū)都標(biāo)明清楚防止來(lái)回取試劑或者設(shè)備時(shí)混淆。實(shí)驗(yàn)臺(tái)等都經(jīng)過(guò)5%的次氯酸鈉溶液消毒,實(shí)驗(yàn)后經(jīng)過(guò)UV照射處理。通過(guò)嚴(yán)格控制和封閉實(shí)驗(yàn),極大的降低了污染率。PURE-LAMP結(jié)果報(bào)告時(shí)間比固體培養(yǎng)快。2h以即可根據(jù)肉眼觀察熒光判定結(jié)果。判斷時(shí)未發(fā)現(xiàn)模糊案例。20%的樣本經(jīng)過(guò)復(fù)檢后重復(fù)率100%?？偟膩?lái)說(shuō),PURE-LAMP是一種全新的診斷技術(shù),可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核病患者,該實(shí)驗(yàn)只需60ul痰液樣本,非常適合檢測(cè)肺結(jié)核病人,尤其是痰液較少患者,本研究表明PURE-LAMP可以用于實(shí)驗(yàn)室篩查結(jié)核病。參考文獻(xiàn)1.WorldHealthOrganization<2013>Globaltuberculosiscontrol:WHOreport2011,Geneva,Switzerland:WorldHealthOrganization.2.SmallPM,PaiM<2010>Tuberculosisdiagnosis–timeforagamechange.NEnglJMed363:1070–1071.3.PaiM,KalantriS,DhedaK<2006>.Newtoolsandemergingtechnologiesforthediagnosisoftuberculosis:partII.Activetuberculosisanddrugresistance.ExpertRevMolDiagn6:423–432.4.ElliottAM,HalwiindiB,HayesRJ,LuoN,TemboG,etal.<1993>TheimpactofhumanimmunedeficiencyvirusonpresentationanddiagnosisoftuberculosisinacohortstudyinZambia.JTropMedHyg96:1–11.5.KleinNC,DuncansonFP,LenoxTH3rd,PittaA,CohenSC,etal.<1989>UseofmycobacterialsmearsinthediagnosisofpulmonarytuberculosisinAIDS/ARCpatients.Chest95:1190–1192.6.AbeC,HiranoK,WadaM,KazumiY,TakahashiM,etal.<1993>DetectionofMycobacteriumtuberculosisinclinicalspecimensbypolymerasechainreactionandGen-ProbeAmplifiedMycobacteriumTuberculosisDirectTest.JClinMicrobiol31:3270–3274.7.HelbD,JonesM,StoryE,BoehmeC,WallaceE,etal.<2010>RapiddetectionofMycobacteriumtuberculosisandrifampinresistancebyuseofon-demand,near-patienttechnology.JClinMicrobiol48:229–237.8.GuoY,ZhouY,WangC,ZhuL,WangS,etal.<2009>Rapid,accuratedeterminationofmultidrugresistanceinM.tuberculosisisolatesandsputumusingabiochipsystem.IntJTubercLungDis13:914–920.9.HuggettJF,McHughTD,ZumlaA<2003>Tuberculosis:amplification-basedclinicaldiagnostictechniques.IntJBiochemCellBiol35:1407–1412.10.SarmientoOL,WeigleKA,AlexanderJ,WeberDJ,MillerWC<2003>Assessmentbymeta-analysisofPCRfordiagnosisofsmear-negativepulmonarytuberculosis.JClinMicrobiol41:3233–3240.11.SuffysP,PalominoJC,CardasoLea?oS,EspitiaC,CataldiA,etal.<2000>EvaluationofthepolymerasechainreactionforthedetectionofMycobacteriumtuberculosis.IntJTubercLungDis4:179–183.12.NotomiT,OkayamaH,MasubuchiH,YonekawaT,WatanabeK,etal.<2000>Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA.NucleicAcidsRes28:63–63.13.AdhikariBR,PandeyBD,GhimireP,ShresthaB,KhadkaM,etal.<2009>Loop-mediatedisothermalamplification<LAMP>forthedirectdetectionofhumanpulmonaryinfectionswithenvironmental<nontuberculosis>mycobacteria.JpnJInfectDis62:212–214.14.PandeyBD,PoudelA,YodaT,TamaruA,OdaN,etal.<2008>Developmentofanin-houseloop-mediatedisothermalamplification<LAMP>assayfordetectionofMycobacteriumtuberculosisandevaluationinsputumsamplesofNepalesepatients.JMedMicrobiol57:439–443.15.IwamotoT,SonobeT,HayashiK<2003>Loop-mediatedisothermalamplificationfordirectdetectionofMycobacteriumtuberculosiscomplex,M.avium,andM.intracellulareinsputumsamples.JClinMicrobiol41:2616–2622.16.BoehmeCC,NabetaP,HenostrozaG,RaqibR,RahimZ,etal.<2007>Operationalfeasibilityofusingloop-mediatedisothermalamplificationfordiagnosisofpulmonarytuberculosisinmicroscopycentersofdevelopingcountries.JClinMicrobiol45:1936–1940.17.MitaraiS,OkumuraM,ToyotaE,YoshiyamaT,AonoA,etal.<2011>Evaluationofasimpleloop-mediatedisothermalamplificatio