壹背景知識貳實驗?zāi)康娜嶒炦^程肆實驗結(jié)果伍實驗討論第1頁/共16頁壹背景知識是一種人工培養(yǎng)，具有無限增殖能力的細胞。

海拉細胞1951年由蓋伊等從人子宮頸癌組織分離出來的株細胞。HeLa是原患者假名海倫·萊恩的縮寫。第2頁/共16頁可以連續(xù)傳代；細胞株不會衰老致死，

并可以無限分裂下去；跟其他癌細胞相比，增

殖異常迅速；

感染性極強。特點第3頁/共16頁動物細胞培養(yǎng)如何進行細胞培養(yǎng)?培養(yǎng)時又需要提供哪些必要條件呢？

從動物機體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和增殖。概念第4頁/共16頁過程胚胎或幼齡動物的組織器官細胞懸液10代細胞50代細胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)用胰蛋白酶分散細胞，說明細胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動物細胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。比老齡動物的組織細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越強，越容易培養(yǎng)。動物細胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細胞增殖緩慢，核型可能變化動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。貼壁生長接觸抑制10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型傳代培養(yǎng)第5頁/共16頁貳實驗?zāi)康难芯咳狈ρ搴桶被岬呐囵B(yǎng)基中的海拉細胞與自噬的關(guān)系。第6頁/共16頁叁實驗過程實驗材料：培養(yǎng)基（10%胎牛血清，0.005M的小蘇打，0.015MTRICINE緩沖液，100單位毫升的青霉素100mg/ml的鏈霉素）；實驗儀器：塑料Falcon玻璃管（25平方厘米和75平方厘米）第7頁/共16頁實驗步驟：細胞培養(yǎng)細胞制備細胞包埋細胞固定光鏡定位和超薄切片第8頁/共16頁保持細胞的生長對數(shù)期，一直進行五次傳代培養(yǎng)，每次當細胞貼壁時快速更換培養(yǎng)基，得到大量的海拉細胞。細胞制備細胞培養(yǎng)實驗組：用缺乏氨基酸，血清的培養(yǎng)基潤洗玻璃管兩次，然后每60分鐘，抽出培養(yǎng)基，立即用新鮮的培養(yǎng)基替換。對照組：培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清以及所有必需氨基酸的組分，在最后三次被以相同方式固定的傳代培養(yǎng)后不再用新鮮培養(yǎng)基潤洗、喂養(yǎng)。第9頁/共16頁細胞固定實驗組：在缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)1,3,6,12,以及24個小時之后，多層單層培養(yǎng)在室溫下塑料瓶中被固定為30分鐘。對照組：巴比妥乙酸鹽緩沖液中在pH4.7梯度乙醇溶液中脫水前用0.5％醋酸雙氧鈾染色細胞的固定單層細胞。細胞包埋在三次環(huán)氧丙烷洗滌之后，細胞將會被環(huán)氧樹脂812浸透，經(jīng)過分離，被放置到填充有環(huán)氧樹脂（杜邦）的BEEM膠囊里去。光鏡定位和超薄切片已分離的細胞層聚合塊進行單層細胞原位超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，觀察酸性磷酸酶反應(yīng)的產(chǎn)物。第10頁/共16頁伍實驗討論在缺乏血清和氨基酸培養(yǎng)的海拉細胞中，觀察到自噬液泡的數(shù)量在以驚人的速度增加。這個細胞自噬模型可以用來進一步研究控制自噬的機制：海拉細胞顯然能夠通過消化自己的細胞質(zhì)來應(yīng)對營養(yǎng)剝奪。一種觀點：第11頁/共16頁另一種觀點：實驗組和對照組中，自噬泡以相同的速度形成，但由于實驗組中缺乏氨基酸和血清，導(dǎo)致次級溶酶體中的酸性水解酶活性降低。故自噬溶酶體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)被溶酶體的酶消化分解的速度減慢，自噬小泡將持續(xù)更長時間，所以造成了一種自噬小泡增多的假象。存在假說：海拉細胞的自噬可以提供氨基酸來合成必需的酶和ATP的底物。因此，這個自噬將代表著一種細胞生存機制。第12頁/共16頁細胞凋亡：是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。核染色質(zhì)的存在是區(qū)分細胞凋亡和自噬作用最有益的標準;第13頁/共16頁異噬：細胞外物質(zhì)（如作為營養(yǎng)成分的大分子顆粒物質(zhì)、細菌、病毒等）經(jīng)吞噬作用或吞飲作用進入細胞，形成吞噬體或吞飲泡。這些異物吞噬液泡很容易區(qū)分,因為他們比較大,都沒有常見于