川芎嗪在小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

四川苦艾酒林的化學(xué)名字叫四甲基吡啶。根據(jù)藥理學(xué)研究，它具有改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腎衰竭和保護(hù)腎功能的作用。這是治療缺血性腦中風(fēng)的首選藥物之一。但川芎嗪在腦內(nèi)的分布并不高,為進(jìn)一步提高川芎嗪對(duì)腦血管類疾病的治療,現(xiàn)選用新的劑型-微乳作為其載體。微乳通常是由乳化劑、助乳化劑、油相和水相組成的澄明或帶乳光的液體,是一種新型藥物載體,可作為速釋、緩釋及靶向給藥系統(tǒng),提高藥物的生物利用度。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見川芎嗪微乳制劑的研究報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)制備川芎嗪微乳并以川芎嗪水溶液作為對(duì)照,采用高效液相色譜法測(cè)定小鼠血、腦、肝中川芎嗪的濃度,分別考察自制川芎嗪微乳在小鼠血、腦、肝中的藥動(dòng)學(xué)行為,為進(jìn)一步研究川芎嗪微乳打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1對(duì)照品的制備川芎嗪(南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司,批號(hào)080220);鹽酸川芎嗪、阿司匹林內(nèi)標(biāo)物對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為110817-200305、100113-200302);川芎嗪微乳、川芎嗪水溶液(自制);甲醇、乙腈均為色譜純。1.2設(shè)備和鉻條件1.2.1儀器、檢測(cè)方法KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);XW—80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);AUY220電子天平(廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司);TGL—16B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司);HPLC儀:SummitP680A泵,SummitPDA—100二級(jí)管陣列檢測(cè)器;Chromeleon色譜工作站(美國(guó)Dionex公司)。1.2.2流動(dòng)相冰醋酸液HypersilODS—C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);甲醇-1.5%冰醋酸溶液(45∶55)為流動(dòng)相;內(nèi)標(biāo)物為阿司匹林對(duì)照品;柱溫:室溫;體積流量:1mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):279nm;進(jìn)樣量:20μL。1.3動(dòng)物NIH小鼠,雌雄不限,體質(zhì)量(20±2)g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào):粵監(jiān)證字2007A013)。1.4生物樣品處理1.4.1內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量的提取取血漿于具塞塑料試管中離心,取上清0.2mL,定量加入0.4mL混有內(nèi)標(biāo)物(3μg/mL)的乙腈液提取,渦旋2min,15000r/min離心10min,移取上清液(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為2μg/mL),即得。1.4.2腦勻漿和肝勻漿的制備取小鼠全腦(剝離軟腦膜)及一葉肝臟(每次均在同一位置),用吸水紙蘸凈殘余血跡,分別精密稱質(zhì)量后加5倍量生理鹽水,用玻璃勻漿器勻漿,得腦勻漿和肝勻漿。離心30min后取上清液0.2mL,加0.4mL混有內(nèi)標(biāo)物(3μg/mL)的乙腈,渦旋2min,15000r/min離心30min,取上清液(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2μg/mL),即得。1.5單次給藥后小鼠腦和肝組織中nh的檢測(cè)取小鼠84只,隨機(jī)分為川芎嗪微乳組和川芎嗪水溶液組各42只,每組各隨機(jī)分為7個(gè)小組(每小組6只),每個(gè)小組分別對(duì)應(yīng)1個(gè)時(shí)間點(diǎn)。小鼠1次性尾iv給藥(川芎嗪給藥劑量為36mg/kg),分別于給藥后2.5、5、10、20、45、60、90min取血。取血時(shí)先用肝素潤(rùn)濕小燒杯,摘除眼球取血。取血后立刻取出小鼠腦和肝組織樣品。并按照1.4中方法處理樣品,得到供試品溶液,并進(jìn)行測(cè)定,將測(cè)得的峰面積以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算血漿、腦、肝中川芎嗪的質(zhì)量濃度。1.6內(nèi)部分析的建立1.6.1對(duì)照品溶液的制備精密稱量12.5mg鹽酸川芎嗪對(duì)照品,置于100mL量瓶中,加乙腈溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液。取空白小鼠血漿、腦勻漿和肝勻漿上清液各2mL,加入鹽酸川芎嗪對(duì)照品溶液適量,按1.4項(xiàng)下方法處理,制成0.00625、0.0312、0.156、0.781、3.906、7.813μg/mL的溶液(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度為2μg/mL),進(jìn)樣。以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比(Y)為縱坐標(biāo),對(duì)照品質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,川芎嗪在血漿、腦和肝中的回歸方程見表1。結(jié)果表明,生物樣品中川芎嗪質(zhì)量濃度在0.00625～7.813μg/mL與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。1.6.2法律研究本課題組前期研究結(jié)果證明該測(cè)定方法穩(wěn)定可行。1.7最佳室模型及非室模型分析采用PKanalyst藥代動(dòng)力學(xué)處理軟件處理,以AIC(Akaikecriteria)、SIC(Schwartzcriteria)最小準(zhǔn)則,結(jié)合擬合度、相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行最佳房室模型的判別,同時(shí)進(jìn)行非房室模型分析,并將微乳組與水溶液組在血、腦、肝中的各個(gè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比。2各組auc的比較小鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1～3及表2。從尾iv2.5min后,開始取血檢測(cè)血漿中川芎嗪的質(zhì)量濃度。此時(shí)微乳組的血藥濃度為4.79μg/mL,水溶液組的血藥濃度為4.42μg/mL,最大血藥濃度無顯著差別。隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),血藥濃度逐漸下降,特別是在前20min內(nèi)下降速度最快,但是每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度微乳組均大于水溶液組。從統(tǒng)計(jì)距參數(shù)看,微乳組與水溶液組的AUC分別為115.70、72.74min·μg/mL,微乳組大于水溶液組,說明微乳提高了川芎嗪在血中的濃度。與血藥濃度測(cè)定結(jié)果不同,腦藥濃度高峰出現(xiàn)在5min,較血中慢,提示藥物從靜脈注射到透過血腦屏障到達(dá)腦部需要一定時(shí)間。其中水溶液組的腦藥濃度Cmax為4.14μg/mL,微乳組可達(dá)到7.81μg/mL,較水溶液組明顯增加,并且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)微乳的腦藥濃度均大于水溶液組,從曲線下面積看,微乳組的AUC為259.51min·μg/mL,水溶液組的AUC為130.19min·μg/mL,微乳組較水溶液組顯著增加,說明微乳組可以顯著提高川芎嗪在腦部的分布,增加腦藥量。肝藥濃度微乳組經(jīng)時(shí)變化與腦藥濃度類似,藥物濃度峰出現(xiàn)在5min,水溶液組肝藥濃度在2.5min,水溶液達(dá)峰時(shí)間較微乳組快,說明微乳在肝中有一定的緩釋作用。比較肝藥峰濃度,微乳組為10.66μg/mL,水溶液只有6.33μg/mL,并且微乳組的AUC大于水溶液組,提示微乳亦改變了川芎嗪藥物在肝中的藥動(dòng)學(xué),增加了肝中的分布。3川浚嗪微乳的腦靶向性研究黃志力等通過對(duì)川芎嗪靜注后大鼠組織中藥物濃度經(jīng)時(shí)變化的觀察,川芎嗪的肝臟攝取率最高,其他依次為心臟、脾、腦、睪丸、肺、腎、肌肉、血漿,其主要分布于血流豐富的大循環(huán)和組織,腦內(nèi)的分布不高。而本實(shí)驗(yàn)川芎嗪微乳與水溶液的比較證明了:微乳可以改變川芎嗪在血、腦、肝的藥動(dòng)學(xué)行為,分布均有所增加,并且腦藥分布提高明顯。微乳增加了川芎嗪在血漿、腦、肝內(nèi)濃集的傾向,血漿中藥物濃度增加說明周圍組織中藥物濃度會(huì)相對(duì)減少,此時(shí)腦藥濃度的顯著提高可能是由于微乳中的油相組分增強(qiáng)了藥物與腦組織的親和性,同時(shí)微乳屬于納米微粒載藥體系,可使微乳攜帶包裹于內(nèi)相(油相)的藥物迅速通過血腦屏障,提高藥物在腦內(nèi)的分布。由以上結(jié)果預(yù)測(cè),川芎嗪微乳具有腦靶向性。川芎嗪常用于腦血管類疾病的治療,但腦內(nèi)的分布并不高,所以今后對(duì)川芎嗪微乳腦靶向性研究具有十分重要的意義。實(shí)驗(yàn)過程中,由于小鼠的個(gè)體差異以及繁瑣的樣品前處理過程,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)難免產(chǎn)生誤差。而與傳統(tǒng)的樣品采集和處理技術(shù)相比,微透析則較有優(yōu)勢(shì):①微透析對(duì)取樣部位的傷害很小,幾乎不影響組織中的生理過程,得到的樣品更能反映物質(zhì)進(jìn)入人體后的實(shí)際變化;②不改變組織