微波提取-壓力氣氛滅菌法測(cè)定水中稀堿水的研究

著名的野生茶，如甜茶、眉毛茶、白茶、龍舌茶和清溪草。屬于葡萄園科蛇葡萄屬的顯齒蛇葡萄園，屬于野生藤本植物。藤茶中含有多種化學(xué)成分,包括水分、蛋白質(zhì)、維生素、多酚和黃酮等,其中黃酮類化合物具有最重要的藥理作用。而二氫楊梅素是其中最重要的黃酮類化合物。二氫楊梅素(Dihydromyricetin,簡(jiǎn)稱DYM)具有黃酮化合物的基本結(jié)構(gòu),且C環(huán)2位和3位碳原子上具H原子,沒(méi)有雙鍵,故在分類上屬于黃酮中的二氫黃酮類化合物。該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。二氫楊梅素具有降血糖、降血脂、保肝、抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛和止咳等藥理作用。所以,二氫楊梅素在食品、保健品以及醫(yī)藥方面有重大的研究前途。本文結(jié)合大量的文獻(xiàn),利用微波裝置和食品高溫高壓滅菌裝置的結(jié)合,用可見(jiàn)分光光度法的測(cè)定,來(lái)探討藤茶二氫楊梅素新的提取工藝。進(jìn)一步提高和簡(jiǎn)化藤茶二氫楊梅素的提取,利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳的提取條件。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1乙醇、試劑和儀器藤茶葉:芳村茶葉市場(chǎng);pH9~10的NaOH堿水:自制;95%乙醇:分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;無(wú)水AlCl3:分析純,廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司;蒸餾水:廣州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制;二氫楊梅素純品:廣東省果蔬深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1稀堿水+轉(zhuǎn)子水準(zhǔn)確稱取1g經(jīng)過(guò)20目的分子篩的藤茶葉,于微波裝置反應(yīng)膠罐中,加入稀堿水,轉(zhuǎn)子。將反應(yīng)膠罐于微波裝置中進(jìn)行微波提取,提取完后,將反應(yīng)膠罐中的藤茶葉及液體全部轉(zhuǎn)移到小燒杯中,封上保險(xiǎn)紙,于高溫高壓裝置中提取,一定時(shí)間及溫度后,趁熱過(guò)濾,濾液待測(cè)。1.2.2空白液的制備將趁熱抽濾的提取液于大試管中,抽取0.1mL于10mL的容量瓶中,用95%的乙醇定容到刻度,搖勻,抽取1mL于另外的10mL容量瓶中,加入3mL的AlCl3,用95%的乙醇定容到刻度,同時(shí)做空白液。在室溫下放置40min,于分光光度計(jì)中測(cè)定。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.1紫外分光光度的測(cè)定稱取微量的二氫楊梅素純品,用95%分析純乙醇溶解并定容至刻度,搖勻。抽取1mL于10mL容量瓶中,精確加入5%AlCl3溶液3mL,95%乙醇定容至刻度,在室溫下放置40min,于紫外分光光度儀UV-2450中掃描,見(jiàn)圖2。從純品的掃描圖圖2可知,最大的吸收波長(zhǎng)是205.80nm。但205.80nm和309.80nm是紫外區(qū),沒(méi)有377nm的可見(jiàn)光區(qū)操作方便。而且從圖3中可看到,提取液的測(cè)定掃描曲線和二氫楊梅素純品的掃描曲線十分相似,都在波長(zhǎng)377nm附近有較穩(wěn)定的吸收。故取吸收峰377nm的2/3,即404nm作為測(cè)定吸光度的波長(zhǎng)。圖3中由上而下(甲、乙、丙)分別是不同條件下二氫楊梅素提取液(甲、乙)及純品二氫楊梅素(丙)的測(cè)定掃描圖。2.2容量瓶測(cè)定方法精確稱取二氫楊梅素純品10.50mg,用95%分析純乙醇溶解,于10mL容量瓶中定容至刻度,搖勻。分別精確地移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于10mL容量瓶中,按1.2.2的測(cè)定方法,于404nm處測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1和圖4。從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得到的回歸方程為:A=6.42x+0.0156,R2=0.9998(n=5)。2.3總黃酮提取率計(jì)算公式將抽濾液按照1.2.2的測(cè)定方法,測(cè)定其提取液的吸光度,其提取率的計(jì)算公式為:式中:A為提取液的吸光度;K為二氫楊梅素在總黃酮中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù),K=0.86。把K=0.86,P=1000代進(jìn)公式后,簡(jiǎn)化為:3微波條件優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)影響藤茶二氫楊梅素因素主要有溶劑的pH值、高溫高壓的時(shí)間、料液比、微波萃取溫度、微波萃取時(shí)間、微波裝置的功率、轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速等因素的影響,分別進(jìn)行單因素的實(shí)驗(yàn),以選擇較好的水平,用正交實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化最佳提取條件。3.1ph值對(duì)提取率的影響由于二氫楊梅素具有多個(gè)羥基官能團(tuán),等電點(diǎn)偏酸性,所以溶劑的pH值對(duì)提取過(guò)程有一定的影響。準(zhǔn)確稱取1g藤茶,料液比為1∶25,微波溫度為95℃,微波時(shí)間為5min,微波功率為600W,高溫高壓時(shí)間為15min,pH值對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)表2和圖5。由圖5可知,稀堿水的提取率最高,宜采用堿性溶劑提取。一般堿水提取時(shí)提取率可提高1%~2%或更多,同時(shí)還易于保存;但堿性不能太強(qiáng),強(qiáng)堿在加熱條件下會(huì)破壞黃酮化合物的母核以及損壞提取容器設(shè)備。3.2料液比的確定二氫楊梅素是一個(gè)極性化合物,水是一種很好的提取劑。不同的料液比對(duì)二氫楊梅素影響較大,因?yàn)槎錀蠲匪貜奶俨柚刑崛〕鰜?lái),水量的多少直接影響其溶解量。料液比對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)表3和圖6。隨著溶劑量的增多,二氫楊梅素的提取率也相繼增大,但從圖6中可以看到,料液比為1∶25以后,藤茶二氫楊梅素的提取率增加幅度很少,水量的增多還會(huì)造成二氫楊梅素的純化的時(shí)間增長(zhǎng),純化率降低。所以從圖6中選擇料液比1∶15~1∶25為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍。3.3微波加熱加熱近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的微波輔助提取技術(shù),具有提取時(shí)間短和提取效率高等優(yōu)點(diǎn)。微波加熱的原理是利用被加熱物質(zhì)的極性分子(如H2O)在微波電磁場(chǎng)中快速轉(zhuǎn)向及定向排列,從而產(chǎn)生撕裂和相互摩擦而發(fā)熱。微波加熱是能量直接作用于被加熱物質(zhì),其模式為:熱源-樣品-器皿。微波作用可以有效地將茶葉的細(xì)胞壁及結(jié)構(gòu)破壞,使有效成分易于從細(xì)胞中釋放出來(lái),但難于擴(kuò)散到溶劑中,所以本實(shí)驗(yàn)把微波加熱作為一種輔助手段,高溫高壓提取把細(xì)胞已經(jīng)被破壞了的茶葉中的二氫楊梅素較好地溶于溶劑中,從而對(duì)提高提取率有很大的幫助。3.3.1微波溫度對(duì)二氫楊樹(shù)牢干制備二氫蝦考慮到二氫楊梅素在熱水中的溶解度較高,但提取溫度不能超過(guò)100℃,否則其他黃酮類會(huì)被提取出來(lái),影響測(cè)定結(jié)果。微波溫度對(duì)提取率的影響見(jiàn)表4和圖7。從圖7可知,微波溫度對(duì)二氫楊梅素的提取影響較大,是一個(gè)重要的影響因素,溫度低于70℃時(shí),提取率非常低,提取率不超過(guò)10%。隨著溫度的提高,提取率也相對(duì)的提高,但是提取溫度不能超過(guò)100℃,因?yàn)樘崛囟仍?00℃以上時(shí)候,其他的黃酮類化合物會(huì)被提取出來(lái),影響測(cè)定結(jié)果,所以在本實(shí)驗(yàn)中微波溫度在95℃時(shí)提取效果最佳。所以選擇溫度75~95℃為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍。3.3.2微波保持時(shí)間對(duì)二氫楊樹(shù)莓原螯蝦提取率的影響微波時(shí)間主要是指,在一定的微波溫度下,微波加熱所保持的時(shí)間。按照1.2.1提取方法和1.2.2測(cè)定方法,微波時(shí)間對(duì)提取率的影響結(jié)果見(jiàn)表5和圖7。從表5和圖7可以看到,微波的保持時(shí)間對(duì)二氫楊梅素的提取有一定的影響,但影響不大。隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng),其提取率也相繼增大,但增大的幅度很少。主要原因可能是微波把茶葉的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,黃酮類化合物被釋放而附在茶葉表面。在微波裝置中,隨著微波保持時(shí)間的延長(zhǎng),藤茶中黃酮類化合物并沒(méi)有溶于溶劑中,所以微波作用只是起到了破壞茶葉細(xì)胞的作用,微波保持時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)二氫楊梅素的提取影響較小。所以選擇微波時(shí)間1~5min為正交實(shí)驗(yàn)的范圍。3.4提取溫度和工氣壓力目前高壓技術(shù)的研究多用于食品的滅菌保存方面,高壓技術(shù)還可用于微生物細(xì)胞破碎,以有效提高細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的提取效率。經(jīng)高壓處理后,提取效率明顯提高。但由于高壓設(shè)備要求比較高,所以采用食品研究中的儀器———壓力蒸氣滅菌器。一定的壓力有助于被微波破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的藤茶中的黃酮類化合物溶于溶劑中,從而提高提取率。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),設(shè)置儀器溫度為105℃,高壓15min和45min后,提取液的溫度為78~94℃,提取液的提取溫度沒(méi)有超過(guò)100℃。105℃下其蒸氣壓力為0.5個(gè)大氣壓?？疾椴煌母邷馗邏簳r(shí)間對(duì)提取過(guò)程的影響,其實(shí)驗(yàn)步驟為:設(shè)置壓力蒸氣滅菌器的溫度為105℃,分別在高溫高壓時(shí)間5、15、30、45、60min條件下,對(duì)按照1.2.1提取方法得到的提取液進(jìn)行處理,按1.2.2測(cè)定方法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6和圖8。從表6和圖8可以看到,二氫楊梅素的提取隨著高溫高壓時(shí)間的延續(xù),其提取率相繼增加,但30min后,二氫楊梅素提取率增大幅度減少,原因可能是二氫楊梅素的提取已達(dá)到了飽和,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),其他雜質(zhì)也相繼提取出來(lái),例如:30min的提取液是黃色的,但60min的提取液是綠色的,初步認(rèn)為是色素、咖啡堿、甘寧等雜質(zhì)的溶出,使提取液的顏色變深。從圖8可以看到,經(jīng)高溫高壓提取后,其曲線與沒(méi)有經(jīng)過(guò)高溫高壓處理的標(biāo)準(zhǔn)曲線在形狀上幾乎一樣,所以,高溫高壓提取沒(méi)有造成二氫楊梅素結(jié)構(gòu)的破壞。高溫高壓對(duì)整個(gè)提取過(guò)程影響較大的,從表4的第5組數(shù)據(jù)可知,沒(méi)有經(jīng)過(guò)高溫高壓提取時(shí),其提取率為20.5%,然后經(jīng)過(guò)高溫高壓提取,其數(shù)據(jù)見(jiàn)表6可知,提取率增大1%~6%。3.5提取過(guò)程的工況和轉(zhuǎn)速微波功率主要的作用體現(xiàn)在溶劑的提溫速度和加熱時(shí)間上,功率越大,提溫速度越快,而且它還對(duì)茶葉細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)選擇功率300~600W為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍。轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速是在提取過(guò)程中,轉(zhuǎn)子起到攪拌的快慢作用。它只在微波裝置起攪拌作用。從低速到高速為正交實(shí)驗(yàn)的水平范圍。4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化最佳提取條件4.1壓力蒸氣滅菌器的正交分析本實(shí)驗(yàn)是以藤茶二氫楊梅素的提取率為單指標(biāo)的。影響二氫楊梅素的提取率主要有兩大部分:微波裝置和壓力蒸氣滅菌器。微波裝置的因素包括:料液比、微波溫度、微波保持時(shí)間、微波功率和轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速。壓力蒸氣滅菌器的主要因素是高溫高壓處理時(shí)間。則本實(shí)驗(yàn)采用6因素3水平的正交方式來(lái)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。從以上討論的單因素對(duì)二氫楊梅素提取率的影響來(lái)確定每個(gè)因素的水平。選擇的料液比水平為:1∶15、1∶20、1∶25;微波溫度水平75、85、95℃;微波保持時(shí)間1、3、5min;微波功率300、500、600W;轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速:低速、中速、高速;高溫高壓提取時(shí)間(105℃)15、30、45min。4.2微波最佳提取條件的確定選用正交表L18(3)7,其6因素3水平的相互作用的結(jié)果見(jiàn)表8和圖9。從正交實(shí)驗(yàn)表的數(shù)據(jù)(表9)可知,影響二氫楊梅素的提取率的因素順序?yàn)?>2>3>5>6>4,即高溫高壓時(shí)間影響最大,接著是料液比>微波時(shí)間>轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速>微波保持時(shí)間。從效應(yīng)曲線圖7可知,最佳的提取條件為高溫高壓時(shí)間45min、料液比1∶25、微波溫度95℃、微波時(shí)間5min、微波功率500W、轉(zhuǎn)子高速。重做實(shí)驗(yàn)18和正交最佳的提取條件,其結(jié)果見(jiàn)表9。從表9的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,正交最佳的提取條件的提取率為30.94%最高,所以本實(shí)驗(yàn)的最佳條件為高溫高壓時(shí)間45min、料液比1∶25、微波溫度95℃、微波時(shí)間5min、微波功率500W、轉(zhuǎn)子高速。5最佳提取條件的確定本實(shí)驗(yàn)由二氫楊梅素的提取到測(cè)定過(guò)程,連貫性較強(qiáng),需要連續(xù)完成。因?yàn)槎錀蠲匪卦诶渌腥芙舛群苄?熱的二氫楊梅素濾液在室溫中放置一段時(shí)間后,因溶劑的降溫,二氫楊梅素會(huì)從溶劑中析出,影響測(cè)定的操作和結(jié)果。藤茶中二氫楊梅素的提取,溫度是關(guān)鍵。提取的溫度但不能超過(guò)100℃,否則其他黃酮類化合物被提取出來(lái),影響測(cè)定結(jié)果。而且,提取液應(yīng)高溫抽濾,避免二氫楊梅素從溶劑中析出。本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定方法是吸光度法。Al3+與二氫楊梅素絡(luò)合顯亮黃色。但是放置時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大,放置時(shí)間以40min為宜。經(jīng)過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn),確定了最佳提取條件為高溫高壓時(shí)間45min,料液比1∶25,微波溫度95℃,微波時(shí)間5min,微波功率500W,轉(zhuǎn)子高速